介导MDR1的RNAi腺病毒载体的构建

【摘要】  目的 介导MDR1的RNAi腺病毒载体, 探讨RNA干扰MDR1基因对人肝癌细胞的作用。方法 根据MDR1mRNA序列构建表达MDR1mRNA特异的shRNA的腺病毒穿梭质粒pshuttle? MDR1。与腺病毒载体体内重组为pAd? MDR1后转染人肝癌细胞SMMC－7721, 以 FCM检测细胞表面膜蛋白P?gp表达阳性率, 以共聚焦显微镜检测细胞内Rh123的潴留,Western Blot检测P?gp蛋白量的变化。结果 构建成pshuttle?MDR1经限制性酶切和PCR证实与设计一致, 将pAd?MDR1转染肝癌细胞SMMC－7721后, FCM检测细胞表面膜蛋白P?gp表达阳性率为22.9%和30.8%,远低于对照组(85.8%)。Western Blot经病毒感染的SMMC?7721/R 的P?gp含量明显低于对照SMMC?7721/R，而与SMMC?7721/S细胞接近。结论 成功构建了pshuttle? MDR1腺病毒载体, 并有效干扰了肝癌细胞细SMMC－7721 MDR1的表达。

【关键词】  RNAi 肝癌细胞 多药耐药基因 腺病毒载体

    0  引  言

    化疗仍是肝癌综合的重要手段之一，但是肿瘤的多药耐药性成为化疗的障碍。其中MDR1基因及其产物的过度表达是多耐药的重要机制之一［1］。我们应用RNAi技术可在细胞水平明显抑制肝癌细胞SMMC－7721和Bel－7402的MDR1的表达［2，3］。为了进一步提高对细胞的转染效率以及为后期的动物实验做准备。我们设计构建了介导对于MDR1的RNAi的腺病毒载体，并进行了功能实验来验证设计思路的正确和载体构建的成功。

    1  材料与方法

    1.1  质粒  质粒PGE?1、腺病毒载体pAdeasy－1及穿梭质粒pshuttle均购自 Stratagene 公司。将针对MDR1的三段siRNA 序列重组到PGE?1质粒构建的shRNA质粒pshMDR11、pshMDR12、 pshMDR13均由本室设计并完成［2，3］。将pshMDR1和pshuttle分别做XhoI和XbaI双酶切并纯化，重组构建成pshuttle? MDR1。

    1．2  细菌培养转化及重组质粒的筛选  大肠杆菌SCS1、gold10 及BJ5183均购自Stratagene 公司。常规氯化钙法转化细菌。pAdeasy－1质粒由含氨苄青霉素LB 培养基筛选，其他均由含卡那霉素LB 培养基筛选。

    1．3  PCR  引物设计：选择Pshuttle MCS两侧设计PCR引物用作重组质粒的筛选，引物序列为: 5’? CGT CGA TTT TTG TGA TGC TCG TCA G?3’和 5’?GAA GCA TTT ATC AGG GTT ATT GTC TCA TG?3’由上海生工合成。PCR反应条件： 94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min。琼脂糖凝胶电泳，未重组Pshuttle质粒为160bp左右产物，而重组质粒在600bp左右。

    1．4  腺病毒载体的构建操作基本照公司操作手册进行，大致如下：重组质粒pshuttle? MDR1经PmeI限制性酶切，与腺病毒质粒padeasy共转化BJ5183菌株, 鉴定后的阳性克隆经扩增、PacI 酶切后,在AD?293细胞中包装完整病毒颗粒。

    1．5  细胞培养与转染  人耐药肝癌细胞株SMMC?7721/R（耐ADM浓度0.2μmol/L）由本室诱导[4]，常规培养于含10%小牛血清，青、链霉素各100U/ml RPMI 1640培养基中。LyoVecTM转染试剂为美国InvivoGen公司脂质体产品，按说明书要求进行转染。转染空载体和无关序列载体作阴性对照，以表达荧光素酶基因的载体及shluc基因的表达质粒作为阳性对照组。

    1.6  细胞表面膜蛋白P?gp表达检测  各组细胞经消化并调整细胞数为1×106/ml, 2%甲醛固定,加入抗P?gp抗体（NeoMarkers 公司产品），4℃孵育2h；加FITC?标记的羊抗鼠IgG FITC?标记的羊抗鼠IgG（美国KPL产品）,室温避光孵育30min，流式细胞仪(Beckman coulter: EPICX XL)检测细胞表面P?gp阳性率。试验重复3次。Western Blot参照Ernesto Yague等［5］的方法，将经培养细胞用Ripa         (Ripa lysis buffer)溶细胞缓冲液(50mMTris?HCl(pH7.4) 150mM NaCl、5mMEGTA 1%Triton X?100 0.1%SDS)溶解，高速离心取上清，与上样缓冲液1∶1混合，经10%电泳分离，电转移到硝酸纤维薄膜，5%奶粉封闭非特异性位点后，与1∶50抗P?gp抗体温育2h，充分洗涤后与1∶50HRP标记的羊抗鼠IgG（华美生物工程公司产品）温育2h，DAB显色

    1．7  细胞内Rh123的潴留检测  调整细胞浓度为1×106/ml，加入Rh123(0.2mg/L)37℃培养箱共孵育45min，冷PBS洗2遍，在0.5h内用流式细胞仪检测细胞内Rh123的强度或者用共聚焦显微镜检测。相同处理组平行5孔，以未经处理的Bel?7402/R细胞为空白对照。

    2  结果

    2．1  表达针对MDR1的shRNA和pshuttle的设计及构建

    pshRNA?MDR1重组表达质粒的构建过程以及体内从DNA模板产生shRNA的策略，见图1。我们前期构建的pshMDR11－3是在PGE－1质粒上插入与MDR1同源的shRNA1－3序列构建而成［2,3］。MDR1shRNA1－3的同源序列分别为5′?GGAGGCCAACATACATGCCTT?3′、  5′?GATCGCTACTGAAGCAATAGA?3′、5′?GGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGT?3′。通过对PGE－1的酶切位点分析发现在PGE－1的起点有一个XhoI酶切位切点，因此用XhoI和XbaI双酶切可以得到包括U6启动子和shRNA序列的完整shRNA表达单元，大小为440bp，并且在pshuttle的MCS上包含此酶切位点，见图1。对PGE－1和pshMDR1的酶切分析表明该质粒不含Pme I和Pac I酶切位点。说明该质粒片段可以用来构建腺病毒表示载体。将带U6启动子的上述质粒扩增及提取后经电泳、回收和与经同样双酶切pshuttle进行连接得到新的重组质粒，分别命名为pshuttle? MDR11、pshuttle? MDR12、pshuttle? MDR13。用PCR鉴定结果显示在相对分子质量600bp左右处有一条明亮的条带，符合阳性克窿的特性，见图2。将其转染到SMMC?7721/R细胞内明显的抑制MDR1功能的表达，实验结果证明了我们设计的正确性。

    2．2  病毒载体的构建及颗粒的包装

    将构建的pshuttle?MDR1经PmeI酶切成线形质粒，再进行去磷酸化以防止其自身环化，与腺病毒骨架质粒 PAdeasy共同转化含重组酶的BJ5183菌株内完成重组。用卡那霉素条件培养基筛选出含有目的片段的重组腺病毒质粒。而骨架质粒PAdeasy因为是氨苄抗性而不能生长。目前我们已构建了表达shRNA1和shRNA3的腺病毒质粒，分别命名为PAd? MDR11和PAd? MDR13。构建产物的正确性由以下两个实验说明：（1）将该质粒经PacI酶切电泳后产生了2条片段，一条为30Kd左右,另一条位于2.5～5Kd之间,符合试剂合说明书要求，见图3；（2）将该质粒PacI酶切产物加入到AD293细胞培养后，提取细胞裂解产物进行PCR,可以得到与pshRNA?MDR1质粒进行PCR的相同结果，见图2。

    2.3  PAd? MDR1对的抑制作用

    将的病毒加入到细胞中，培养一周后进行下述实验证明对MDR1表达的抑制作用。

    2．3．1  罗丹明潴留试验

    罗丹明123在细胞内的潴留反映了MDR1的产物P?gp的功能。罗丹明123与细胞共培养后经流式细胞仪检测结果提示, PAd? MDR11和PAd? MDR13转染的细胞平均荧光强度显著高于SMMC?7721/R细胞系细胞，阳性率分别为91.5%、90.8%，后者阳性率为29.7%，见表1。共聚焦结果也显示了彼此之间的差异，见图4。

    2．3．2   P?gp表达的检测

    用间接免疫荧光法检测细胞膜表面P?gp，经流式细胞仪检测可见各组细胞的阳性率分别是：SMMC?7721/S,26.3%; SMMC?7721/R,85.3%; SMMC?7721/R+PAd?MDR11 22.9%;SMMC?7721/R+PAd? MDR13,30.8%;SMMC?7721/R+PGE?1,85.8%（图略）。Western Blot结果也表明：2μg相同蛋白量的样品中，经病毒感染的SMMC?7721/R在170Kd处的显色明显低于对照SMMC?7721/R，而与SMMC?7721/S细胞接近，见图5。表1  细胞内R123的积累量

    3  讨论

    为克服肿瘤化疗过程中的耐药性问题, MDR1的研究一直是热点之一。此前曾经起来了针对MDR1基因的反义核苷酸技术和针对MDR1产物的抗原抗体技术［6］。由于RNAi技术在基因表达控制方面具有独特优势，本实验室和其他一些实验室纷纷开展了RNAi用于MDR1的研究，技术路线各有差异，包括化学合成siRNA、质粒介导的和病毒介导的体内表达shRNA等方法［7?10］。

    本实验室自2002年以来先期开展了PGE?1质粒介导的shRNA抑制肝癌细胞MDR1的研究并取得了一些成果。我们针对的MDR1不同位点设计了三段shRNA分别作用于耐药肝癌细胞SMMC－7721/R和Bel－7402R，本文中我们又将其中两段shRNA构建到腺病毒载体上作用于SMMC－7721/R，均取得了较好的抑制MDR1效果。应用腺病毒载体进行RNAi研究, 我们认为有以下优势:（1）可以感染不同细胞类型。RNAi的效果除了受DNA靶点影响外，细胞间的差异也是重要因素。Christiane Nieth等［11］用同样siRNA分别对胃癌细胞EPG85?257RDB和胰腺癌细胞EPP85?181RDB做RNAi, 结果虽然使MDR1 mRNA下降均在90%左右，但对阿霉素的抵抗两者差别较大（89% vs 58%）。而Stewart等［12,13］则指出：不同细胞处理shRNA的能力不同而导致RNAi的效果不同；（2）可以提高siRNA转入细胞效率；（3）即可以转染分裂细胞又可以转染静止细胞，还可以进行活体转染。相信将在后期的动物实验工作中发挥重要作用。

【】
  ［1］ Grude P, Conti F, Mennecier D, et al. MDR1 gene expression in hepatocellular carcinoma and the peritumoral liver of patients with and without cirrhosis［J］. Cancer Letters, 2002, 186:107?113.

［2］ 胡礼仪,周新,张有顺，等.载体介导的RNA 干扰抑制肝癌耐药细胞MDR1 表达的实验研究［J］.肿瘤防治杂志，2004,11（11）：1158.

［3］ 秦伟超,张有顺,周新，等.抑制MDR1基因表达shRNA RNAi系统的构建［J］.山东医药，2005，45（13）：19?20.

［4］ 王学军，戴宗晴，刘志苏，等.人肝癌多药耐药细胞株建立及MDR1稳定表达的研究［J］.实用癌症杂志，2003，18（6）：580.

［5］Ernesto Yague, Angel L. Armesilla, Georgina Harrison：P?glycoprotein (MDR1) Expression in Leukemic Cells IsRegulated at Two Distinct Steps, mRNA Stabilization andTranslational Initiation THE J［J］.OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2003, 278（12）: 10344?10352.

［6］Celius T, Garberg P, Lundgren B：Stable suppression of MDR1 gene expression and function by RNAi in Caco?2 cells. Biochem Biophys Res Commun, 2004,324(1):365?371.

［7］ 王萍玲,胡丽娜,邓凯贤,等.RNA干扰沉默mdr1基因联合阿霉素对卵巢癌耐药细胞株SKOV 3/ADM增殖的抑制作用［J］.重庆医科大学学报，2005 ， 30（02）：18.

［8］ 彭智，肖志坚，王一,等.SiRNA逆转K562/A02细胞多药耐药的研究［J］.中华血液学杂志，2004，25：5?7.

［9］ 李臣宾,张峰,史玉荣，等.小干扰RNA引发多药耐药乳腺癌细胞内MDR1基因沉默研究［J］.中华实验外科杂志，2004 ，21（10）：1199?1201.

［10］胡海燕,张洹.SiRNA对肺癌细胞株NCI-H460 bcl?2基因表达的影响［J］.暨南大学学报，2005 26:(02) 174?180.

［11］Nieth C, Priebsch A, Stege A, et al.Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi)［J］. FEBS Lett, 2003,545(2?3):144?150.

［12］Stewart SA et al. Lentivirus?delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells［J］. Rna, 2003, 9: 493?501.

［13］Yague E, Higgins CF, Raguz S：Complete reversal of multidrug resistance by stable expression of small interfering RNAs targeting MDR1［J］. Gene Ther, 2004,11(14):1170?1174.