CD44v6、E?cadhesion表达与乳腺浸润性癌预后的关系

【摘要】  目的 检测CD44v6、E?cad在乳腺浸润性癌中的表达情况，探讨它们与乳腺浸润性癌浸润和转移的关系。方法 采用免疫组化SP法检测103例乳腺浸润性癌中CD44v6、E?cad的表达，结合病理指标和临床指标分析其与预后的关系。结果 CD44v6蛋白表达在细胞浆和(或)细胞膜上，阳性表达率为76.7%（79/103）。E?cad蛋白表达主要见于细胞膜，阳性表达率为35.0%（36/103）。 CD44v6、E?cad蛋白表达与乳腺浸润性癌组织学类型无关（P＞0.05），与组织学分级及组织浸润程度有关（P<0.05）。在56例有随访记录的患者中，CD44v6、E?cad蛋白表达与患者年龄无关（P＞0.05），与腋窝淋巴结转移、局部复发、远处转移均有关（P<0.05）。两者在同一癌组织中的表达呈负相关（P<0.01）。结论 CD44v6、E?cad蛋白表达与腋窝淋巴结转移、局部复发、远处转移有关（P<0.05），因此CD44v6、E?cad蛋白表达可作为判断乳腺浸润性癌的浸润程度、预测预后的指标之一。

【关键词】  乳腺浸润性癌 CD44v6、E?cad蛋白 预后 转移

    恶性肿瘤转移的机制非常复杂，Liotta等[1]概括肿瘤细胞浸润和转移的三步假说为粘附、降解和移动。上述过程中，癌细胞与血管内皮及皮下基底膜异质粘附是其侵袭、转移的关键。恶性肿瘤的发生、还与癌基因(c?erb2、c?myc、ras)和抑癌基因（p53、nm23）等的异常表达有关。有研究表明，CD44的异常表达可早于ras、p53等基因的异常,所以CD44的变异可能与ras癌基因激活有关,是形成恶性肿瘤的因素之一[2]。肿瘤细胞从原发部位脱落是肿瘤转移的第一步，这与细胞粘附功能降低有关，钙离子依赖性细胞粘附分子E?cad在维持细胞粘附过程中起重要作用。研究发现多种肿瘤中存在E?cad表达异常[3，4]。本实验利用免疫组织化学法检测了乳腺浸润性癌中CD44v6、E?cad的表达情况，结合临床指标，探讨它们与乳腺浸润性癌的相关性，以期为临床诊断、、判断乳腺癌患者预后提供理论依据。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料

    收集兰州大学医学部病理教研室及兰州大学第一附属病理科手术切除女性乳腺癌标本103例。组织学分型按照世界卫生组织肿瘤分类标准[5]分类。其中小管癌72例，浸润性导管癌11例，浸润性小叶癌7例，髓样癌13例。术前均未曾接受放疗和化疗，56例有随访记录，年龄23～76岁，平均48.2岁。年龄≤50岁21例，>50岁35例， 7例患者术后有复发或死亡，肿瘤大小>3cm者44例，≤3cm者12例。无腋窝淋巴结转移者11例，有腋窝淋巴结转移者45例。局部复发14例，远处转移20例。标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，制成4μm薄切片，进行常规HE、免疫组织化学染色。

    1.2  试剂

    鼠抗人CD44v6、E?cad,SP免疫组化染色试剂盒，DAB显色剂购于福州迈新生物技术公司。

    1.3  方法

    1.3.1  免疫组织化学染色  采用SP法染色，石蜡切片制成4μm薄片，依次二甲苯脱腊，梯度乙醇水化，PBS(pH=7.4)冲洗3次。3％H2O2甲醛溶液室温孵育10min，微波抗原修复10min，室温冷却后，10％羊血清37℃孵育20min，滴加一抗，4℃冰箱过夜。复温1h，PBS冲洗3次。加入链亲和素－过氧化酶溶液室温下孵育10min，PBS洗3次，0.04％DAB?0.03% H2O2 室温显微镜下控制显色5～10min，苏木素复染后，脱水，透明，封片， PBS代替一抗作阴性对照。

    1.3.2  结果判定  以低倍镜和高倍镜分别观察切片，阳性细胞为镜下组织细胞结构清晰，细胞膜和(或)细胞浆棕色颗粒沉着，染色明显高于背景，根据细胞百分率及显色深浅计分：（1）阳性细胞百分率：无细胞显色为0；＜25%细胞显色为1；25%～50%细胞显色为2；>50%细胞显色为3。（2）显色深浅不一或显色不清为0；浅黄色为1；棕黄色为2；深褐色为3。两项乘积：0～1分为（－）；2～3分为弱阳性（＋）；4～5分为中度阳性（＋＋）；>5分为强阳性（＋＋＋）。为便于统计，将弱阳性和中度阳性，强阳性归为阳性（＋）。CD44v6以细胞浆（膜）出现棕色颗粒为阳性细胞。E?cad粘附分子跨膜蛋白定位于细胞膜，计细胞膜棕染为阳性细胞。

    1.3.3  统计学处理  采用SPSS10.0统计软件进行检验。

    2  结果

    2.1  103例乳腺浸润性癌CD44v6、E?cad蛋白表达结果

    CD44v6蛋白表达在细胞浆和(或)细胞膜上（图略）。其阳性表达率为76.7%（79/103）。CD44v6蛋白表达与乳腺浸润性癌组织学类型无关（P＞0.05），与组织学分级及组织浸润程度有关（P<0.01）。E?cad蛋白表达主要见于细胞膜（图略）。其阳性表达率为35.0%（36/103）。E?cad蛋白表达与乳腺浸润性癌组织学类型无关（P＞0.05），与组织学分级及组织浸润程度有关（P<0.05），见表1。表1  乳腺浸润性癌CD44v6、E?cad蛋白表达水平与病理指标的关系

    病理因素例数CD44V6蛋白表达－＋阳性率(%)χ2PE?cad蛋白表达－＋阳性率(%)χ2P组织类型  髓样癌134969.210323.1  浸润性

    小叶癌72571.46114.3  小管癌72155779.29.757

    （v=6）0.135*462636.13.982

    (v=6)0.263*  浸润性

    导管癌113872.75654.5组织分级  Ⅰ级38162257.9132565.8  Ⅱ级2332087.017.620

    (v=4)0.00118521.725.550

    (v=4)0.000  Ⅲ级4253788.136614.3组织浸润  Ⅰ级2112955.881311.6  Ⅱ级3943587.517.822

    (v=4)0.001271230.08.671

    (v=4)0.013  Ⅲ级4383595.2321176.2

    *Wilocoxon Mann?Whitney test表2  乳腺浸润性癌CD44v6、E?cad蛋白表达水平与临床指标的关系

    临床

    病理指标例数CD44v6蛋白表达－＋阳性率(%)χ2PE?cad蛋白表达－＋阳性率(%)χ2P年龄  ≤50岁2171466.712942.9  >50岁3592674.32.677

    （v=2）0.262211440.00.044

    (v=1)0.520肿瘤大小  ≤3cm129325.014.977

    (v=2)0.0014866.74.134

    (v=1)0.062  >3cm4473784.1291534.1腋淋巴结转  移  无118327.33872.7  有4583768.815.832

    (v＝4)0.003301533.35.688

    (v=1)0.013局部复发  无42142866.78.936

    （v=2）0.012212150.05.534

    (v=1)0.012  有1421285.712214.3远处转移  无36142261.17.610

    (v=2)0.01258.312.410

    (v=1)  有2021890.010.0随访结果

    健在38132565.8191950.0  带癌112981.810.330

    (v=4)0.0358327.34.117*

    (v=2)0.181*  死亡71685.76114.3

    *Wilocoxon Mann?Whitney test    在56例有随访记录的患者中，CD44v6蛋白表达与患者年龄无关（P＞0.05），与肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、局部复发、远处转移、生存时间均有关系（P<0.05）。E?cad蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、生存时间无关（P＞0.05），与腋窝淋巴结转移、局部复发、远处转移有关（P<0.05），见表2。

    2.2  103例乳腺浸润性癌CD44v6、E?cad蛋白表达的相互关系

    103例浸润性乳腺癌中，CD44v6与E?cad表达均阳性者27例，均阴性者15例。52例CD44v6蛋白表达阳性，而E?cad表达阴性。9例E?cad表达阳性，CD44v6蛋白表达阴性。两者在同一癌组织中的表达呈负相关（P<0.01）。

    3  讨论

    CD44蛋白是分布极为广泛、具有高度异质性的单链跨膜糖蛋白，是在淋巴细胞成熟和归巢过程中起重要作用的细胞表面粘附分子，能与多种配体和透明质酸、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等结合，参与细胞与细胞、细胞与ECM之间的特意性粘连。编码CD44蛋白的基因位于人第十一号染色体短臂上，由至少19个外显子组合而成。在转录过程中，只有9个外显子固定表达，合成标准型CD44蛋白（CD44s）,广泛存在于许多细胞，CD44s主要作为透明质酸受体，结合透明质酸后影响肿瘤的生长和转移。其余可一个或多个通过不同组合插入相应的mRNA链中，由此指导合成一系列结构相似但分子大小相异、功能有别的CD44蛋白即选择性拼接变异体（CD44v），有组织特异性，CD44v主要表达于转移的肿瘤细胞，CD44v的高表达构成了肿瘤细胞的侵袭性与易转移性。以往研究结果对于CD44v6在乳腺浸润性癌中的作用有不同的意见［6?9］。本研究结果显示CD44v6表达与乳腺癌各临床病理指标之间有显著相关，特别是腋淋巴结转移组与无淋巴结转移组差异明显，这说明CD44v6表达与乳腺癌浸润、转移的相关性较大，临床中可单独应用CD44v6进行检测，CD44v6阳性表达的乳腺癌预后较差。

    E?cad是一类介导细胞间相互粘附的钙依赖性跨膜糖蛋白，参与形成和维持正常细胞间的连接。由于E?cad是上皮细胞中的粘附分子，故对上皮细胞的极性和分化十分必要，其阳性表达有抑制肿瘤转移的作用，当E?cad表达降低，或其他因素损害E?cad的粘附功能时，肿瘤细胞易于脱落并逃离原发灶发生浸润、转移。有研究发现E?cad表达降低与癌的分化、侵袭和转移有显著的相关性［10，11］。本研究结果显示，E?cad的阳性表达与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移呈负相关；提示E?cad的表达降低，消弱了乳腺癌细胞间的粘附功能，在其他促转移因素作用下，加速乳腺癌的侵袭、转移。本研究结果显示乳腺浸润性癌组织中E?cad失表达与CD44v6高表达之间存在负相关。表明E?cad阴性、CD44v6阳性的乳腺浸润性癌易于脱离瘤体，在CD44v6分子的介导下癌细胞粘附于血管、淋巴管，促使侵袭、转移发生。

【】
  ［1］ Liotta LA, Rao CN, Barsky SH. Tumor invasion and the extracellular matrix/[J/]. Lab Invest, 1983, 49(6): 636?649.

［2］ 王杰军，高勇，许青.肿瘤转移机制及诊疗进展/[M/].上海：第二军医大学出版社,2002.33?34.

［3］ Hugh IJ, Dillon SA, Taylor BA, et al. Cadherin?catenins expression in primary colorectal cancer: a survival analysis/[J/]. Br J Cancer, 1999, 80(7): 1046?1051.

［4］ 皋岚香，丁华野.新版WHO乳腺浸润性癌组织学类型的特点概述/[J/].中华病杂志,2004,33(4)：382?384.

［5］Tavassoli FA,Soares J,Myoepithelial lesions.In: Tavassoli FA, Devilee P,eds.World Health Organization classification of tumours.In: WHO,ed.Pathology and genetics of tumours of the breast and female gential organs. Lyon: LAGC Press, 2003.

［6］Laube F. Co?localization of CD44 and urokinase?type plasminogen activator on the surface of human melanoma cells. Anticancer?Res/[J/].2000, 20(6): 5045?5048.

［7］Bnatavadekar JM, Padel DD, Chikhlikar PR, et al. Overexpression of CD44: a useful independent predictor of prognosis in patients with colorectal carcinoma/[J/]. Ann Surg Oncol, 1998,5(6)：495?501.

［8］ 侯富林，林秋雄.CD44v6蛋白在乳腺癌中的表达及其与转移的关系/[J/].中华病理学杂志,2000,29（4）：283?284.

［9］ Jnes S,Clark G, Koleszar S,et al. Low proliferative rate of invasive node?negative breast cancer predicts for a favorable outcome: a prospective evaluation of 699 patients/[J/].Clin Brest cancer,2001,1(4):310?314.

［10］Sato F, Shimada Y, Watanabe G, et al. Expression of vascular endothelial growth factor, matrix metalloproteinase?9 and E?cadherin in the process of lymph node metastasis in esophageal cancer/[J/]. Br J Cancer,1999, 80(9):1366?1372.

［11］Yu Q, Stamenkovi CI. Localization of matrix metalloproteinase 9 to the cell surface provides a mechanism for CD44?mediated tumor invasion/[J/]. Genes Dev, 1999, 13(1):35?48.