B?ALL患者胸腺输出TCR Vβ亚家族na?ve T细胞分析
【摘要】 目的 了解B细胞?急性淋巴细胞白血病（B?ALL）患者外周血T细胞中TCR Vβ亚家族23种信号T细胞受体删除DNA环（sjTRECs）的存在情况，从而了解胸腺近期输出各TCR Vβ亚家族 na?ve T细胞的功能。方法 利用半巢式PCR分别扩增10例B?ALL患者外周血单个核细胞DNA中的23种Vβ～Dβ1 sjTRECs，10例正常人作为对照。结果 TCR Vβ亚家族sjTRECs在大部分正常人和部分B?ALL患者中均可检测到，与正常人比较，B?ALL病人的Vβ24～Dβ1 sjTRECs出现频率比正常人高，且有统计学意义（80%∶30%, P=0.0285），另有18个家族的Vβ～Dβ1 sjTRECs比正常人低，其中在Vβ1（30%, P=0.0285）、Vβ12（20%,P=0.0285）、Vβ13（40%, P=0.0043）、Vβ15（20%, P=0.0022）和Vβ18（20%, P=0.0089）5个亚家族sjTRECs出现频率的差异有统计学意义。结论 B?ALL病人胸腺输出大多数Vβ亚家族na?ve T细胞功能低于正常人。
【关键词】 急性淋巴细胞白血病 T细胞受体删除DNA环 胸腺近期输出功能
0 引言
白血病患者常伴有细胞免疫功能缺陷，既往的研究多数仅了解病人的外周血中所表现的细胞免疫状态，而未能更好地了解其胸腺功能情况。自从1998年Douek等首次报道通过定量检测外周血中T细胞受体删除DNA环（T?cell receptor excision DNA circles, TRECs或称sjTRECs）从而检测胸腺近期的输出功能后，sjTRECs被用来作为测量近期胸腺输出的敏感指标，应用于多种免疫缺陷性疾病等的检测[1?3]。我们的前期研究报道了正常人和白血病患者外周血中sjTRECs的定量检测情况[4,5]。对δRec?ψJα sjTRECs分析仅代表了总的胸腺近期输出功能，而不能具体到各亚家族的sjTRECs的情况。本研究在建立了对TCR Vβ亚家族 sjTRECs检测的基础上，分析B细胞-急性淋巴细胞白血病（B?ALL）患者Vβ亚家族na?ve T细胞的近期胸腺输出情况。
1 资料与方法
1.1 资料
经细胞形态学和细胞组化，按FAB分型确诊的表1 用于PCR和半巢式PCR的引物序列及半巢式PCR产物
引物序列作用半巢式PCR产物（bp） Vβ1?Y15’ccggagtgaggagggacagtgcagaggtg 3’ 下游引物 556bp Vβ2?Y15’gcacacacactcccagatgtctcagtcaggaaagc 3’下游引物400bpVβ3?Y15’catcggagccagcaccagccctgagttag 3’下游引物345bpVβ4?Y15’atacccatgcccacccacaaacacagaaacag 3’下游引物419bpVβ5?Y15’ttttccccagccctgagttgcagaaagcccc 3’下游引物431bpVβ6?Y15’gccacgattgcttccaccacccacatttacag 3’下游引物472bpVβ7?Y1 5’ggcagagtcacactcaggcaaaaggaaaccc 3下游引物469bpVβ8?Y1 5’gcagcccttctcaagagcccccaccattc 3’下游引物596bpVβ9?Y15’gtgccacacagaaagaaaagaaagagcttccc 3’下游引物592bpVβ10?Y15’cgtagtgcctaccaacctgctacacacttatttcc 3’下游引物339bpVβ11?Y15’ggcaagatgtcctcacattagaggcgaccctttc 3’下游引物321bpVβ12?Y15’agttggtctgagactggggtaggaatggacg 3’下游引物452bpVβ13?Y15’gcaacaaaggagacatctgaggacctgggacc 3’下游引物490bpVβ14?Y15’cagtgagcttgtcctgcccaactttgaaacc 3’下游引物499bpVβ15?Y15’ctaaacaccccacatcccacaacccacatcc 3’下游引物362bpVβ16?Y1 5’cctcacagtcagagtcacaaacctttcagagcag 3’下游引物585bpVβ17?Y15’cgtttcctgccatcatagagtgcagaggagccctgt 3’下游引物357bpVβ18?Y15’tcctacaatcctcccctatttccaccctcaac 3’下游引物416bpVβ19?Y15’ctcccttccagcctaatacatcacctgcttcc 3’下游引物343bpVβ21?Y15’tgagcccagatcgcaccactgcactccagcc 3’下游引物510bpVβ22?Y15’agctgcaagaacaaacccaaccagagacttcc 3’下游引物379bpVβ23?Y1 5’gcagcccccacctccttctccctattacatcc 3’下游引物342bpVβ24?Y15’gtctacagatattgacagccaccaacccacttcc 3’下游引物391bpDβ1?Y25’gtcatagcttaaaaccctccgagtgacgcacagcc 3’首次PCR上游引物 Dβ1?Y35’agaccagccccttcgccaaacagccttac 3’半巢式PCR上游引物
初发未治B?ALL患者10例（男8例，女2例），年龄3～77岁，中位年龄33岁。10例正常人外周血作为对照，年龄25～43岁。分离外周血单个核细胞，提取DNA，均按常规方法进行。
1.2 引物设计
根据基因库所提供的TCRβ基因组全长核苷酸序列（ACCESSION：U66059，U66060，U66061）设计引物。于各TCRVβ基因位点下游的非编码区设计1个下游引物（Y1）和Dβ1基因片段上游非编码区设2个上游引物（外侧引物Y2，内侧引物Y3）[6?8]，引物的方向恰好与一般的PCR引物相反，只有当所在的Vβ基因片段与Dβ1基因片段发生重排，所删除的非编码区片段形成一环形DNA时，才能扩增到PCR产物。由于Vβ20亚家族基因重排时不形成sjTRECs，故本试验不检测该亚家族。本研究所采用的引物，见表1。
1.3 半巢式PCR
首次PCR分别应用下游引物Y1和外侧引物Y2进行各Vβ～Dβ1 sjTRECs的PCR扩增；然后以首次PCR产物（2 μl）为模板，分别利用下游引物Y1和相应的上游内侧引物Y3进行半巢式PCR扩增。总反应体积为20 μl，首次及半巢式PCR模板量均为2 μl、10 μmol/L引物、1 mmol/L dNTP、2 u Taq 聚合酶（Promega）、10×Buffer缓冲液和1.5 mmol/L MgCl2。反应在PCR扩增仪（BioMetra）中进行。在94℃、3 min预变性后，首次及半巢式PCR均进行30个循环，每一循环包括：94℃ 1 min，65℃（第二次PCR为70℃）1.5 min 和72℃ 1.5 min（末次6 min），PCR产物保存于4℃中备用。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶（溴乙锭染色）中电泳分析结果[7]。
1.4 统计学处理
两组样本中23个TCR Vβ亚家族sjTRECs检测情况用检出率来表示，显著性检验用四格表的Fisher确切概率法检验。
2 结果
各亚家族TCR Vβ～Dβ1 sjTRECs在大部分正常人及部分B?ALL患者外周血T细胞DNA中均可检测到，见图1，两组检出率结果见图2。10例正常人的Vβ～Dβ1 sjTRECs检出率多数较高，其中Vβ10、Vβ13和Vβ14的sjTRECs检出率为100%，Vβ3、Vβ5、Vβ15和Vβ22的sjTRECs检出率为90%。而10例患者的Vβ～Dβ1sjTRECs 中23个亚家族中有13个亚家族低于50%，Vβ24亚家族检出率最高为80%。与正常人比较显示：10例患者中1个家族（Vβ24）sjTRECs出现频率比正常人高且有统计学意义（P=0.0285），1个家族（Vβ11）sjTRECs出现频率比正常人高但无统计学意义（P=0.6477），3个家族（Vβ2、Vβ6 、Vβ19）sjTRECs出现频率与正常人相同，其余18个家族比正常人低，其中在Vβ1（30%, P=0.0285）、Vβ12（20%, P=0.0285）、Vβ13（40%, P=0.0043）、Vβ15（20%, P=0.0022）和Vβ18（20%, P=0.0089）5个亚家族sjTRECs出现频率的差异有统计学意义。
3 讨论
B?ALL为造血系统常见的恶性肿瘤，由于B细胞恶性克隆性增生，不仅出现机体体液免疫功能异常，也常常累及细胞免疫功能[9]。近期有研究报道儿童B淋巴细胞肿瘤胸腺近期输出功能的情况，本研究则进一步分析其各Vβ亚家族胸腺输出功能的特点。
分析TCRVβ～Dβ1 sjTRECs的原理是基于T细胞在胸腺中发育成熟过程中，T细胞受体Vβ基因所形成的T细胞受体删除DNA环（TRECs）或信号结合T细胞受体删除环（sjTRECs）。sjTREC为游离基因，并不随着T细胞的进一步分裂而扩增，外周血中的sjTREC的含量代表了TCR基因初始重排形成有功能TCR时的na?ve T细胞的含量，分析各Vβ亚家族重排时所形成的sjTREC则可以了解各亚家族na?ve T细胞的存在情况，即可代表胸腺近期的输出功能。我们前期的研究已经建立了TCR Dβ～Jβ和部分Vβ～Dβ1 sjTRECs的分析方法[7,8]，同时也报道了多种白血病中胸腺近期输出功能低下的情况[4,5]。
本研究采用半巢式PCR方法扩增了10例B?ALL患者外周血单个核细胞TCR Vβ谱系基因重排时形成的23种Vβ～Dβ1 sjTRECs。初步结果提示B?ALL胸腺近期Vβ各个亚家族na?ve T细胞可以从外周血中检测到。在TCR Vβ谱系23个亚家族中有18个亚家族sjTRECs正常人检出率高于患者，且其中5个（Vβ1、Vβ12、Vβ13、Vβ15、Vβ18）亚家族有统计学意义。研究的结果提示B?ALL病人胸腺近期输出各Vβ亚家族na?ve T细胞绝大多数低于正常情况，进一步说明胸腺近期输出各Vβ亚家族的na?ve T细胞也存在不平衡的情况，这与检测患者总的胸腺输出功能以及检测各Vβ亚家族基因谱系的情况相吻合[9,10]。本研究成功检测并率先提供了B?ALL患者外周血单个核细胞中Vβ 23个亚家族sjTRECs的存在情况，从而为初步了解B?ALL患者Vβ谱系na?ve T细胞的输出情况提供了新的资料，接下来还需要进一步进行定量PCR检测，以更确切了解胸腺近期na?veT细胞的输出情况。
【】
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