姜黄素对膀胱癌细胞的p300表达的影响
作者：方武,李文威,高淑华,邓和鸣,李香普
【摘要】 目的 了解姜黄素对p300表达的影响，探讨其抗膀胱癌的机制。方法 用不同浓度的姜黄素作用膀胱癌细胞T24，MTT法检测细胞增殖抑制率,RT?PCR法检测p300、c?fos、c?jun的mRNA表达，蛋白免疫印迹法检测乙酰化组蛋白H3、H4、c?fos、c?jun、p300蛋白表达。结果 姜黄素能抑制T24细胞增殖，且具有量效关系和时效关系。姜黄素能抑制 p300、c?fos、c?jun mRNA和蛋白的表达，抑制组蛋白H3、H4的乙酰化，也具有量效关系。结论 姜黄素可以抑制p300的表达，此可能是姜黄素抗膀胱癌的机制之一。
【关键词】 姜黄素； p300； c?fos； c?jun
姜黄素(Curcumin)是从植物姜黄中提取出来的一种酚类色素, 具有抗癌作用。姜黄素可以通过多条途径发挥抗癌作用，如下调癌基因的表达，上调抑癌基因的表达,但是其具体机制还不清楚。p300蛋白具有调节基因表达和细胞增殖的作用。Karanam B等[1]报道姜黄素可以抑制p300/CBP的表达和活性，调节基因的表达，目前国内尚未见姜黄素对膀胱癌p300影响的报道。因此，本实验试图研究姜黄素对膀胱癌细胞T24的p300表达的影响，及其对乙酰化组蛋白H3、H4、原癌基因c?fos、c?jun的表达影响，从组蛋白乙酰化与基因的表达和调控的角度初步探讨姜黄素抗膀胱癌的机制。
1 材料与方法
1.1 药物 姜黄素（Sigma公司产品）用DMSO稀释成1×105 μmol/L置于-20℃保存,临用前解冻，处理细胞时加入到10% FBS的DMEM培养液中。
1.2 细胞培养及处理 人膀胱癌细胞系T24，移形细胞癌,购自上海细胞所;用含10%小牛血清的DMEM培养液,在37℃、5% ＣＯ2及饱和湿度下培养, 48h换液一次。取对数生长期细胞进行实验。
1.3 MTT比色实验 1×104细胞接种于96孔培养板中,培养24h后，按实验要求分别在T24细胞中加入终浓度为0、15、30、45 μmol/L的姜黄素, 0μmol/L即为对照组，每组3复孔。分别培养12、24、48、72h后,应用ELX 800型酶标仪(美国Bio?Tek公司),进行MTT检测，波长为560 nm,根据MTT的吸光度(A)值,出MTT细胞增殖抑制率：
增殖抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%
1.4 RT?PCR法检测p300、c?fos、c?jun的mRNA的表达 用RNA提取试剂盒、AMV第一链cDNA合成试剂盒（上海生工）提取RNA和反转录为cDNA，再经PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳，结果用AlphaImager3400型凝胶图像分析仪(美国Alpha Innotech公司产品)照相并分析。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。每个实验重复3次。引物序列及反应条件，见表1。表1 各反应引物的序列和反应条件
1.5 免疫印迹法检测乙酰化组蛋白H3、H4、p300、c?fos、c?jun的表达 按实验分组要求收集细胞,加入三去污裂解液进行细胞裂解，于4℃离心10min,弃除沉淀，BCA法进行蛋白定量，取50μg蛋白加入4×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热10min以使蛋白质变性。用6% SDS?聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，转PVDF膜，丽春红染色观察转移效果，并确定蛋白分子量标准位置。5%脱脂牛奶封闭2h按1∶200加入羊抗人乙酰化组蛋白H3(Lys9)、H4(Lys8)抗体(基因公司)、羊抗人p300多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），β?actin 抗体(Santa Cruz公司), c?fos和c?jun鼠抗人单克隆抗体（北京中山生物技术公司），室温孵育2h，TBST洗3次，1∶2000加入辣根过氧化物酶标记兔抗羊、兔抗鼠二抗，室温孵育1h，TBST洗3次，用Western blot印迹荧光检测试剂盒显示于X线片。用AlphaImager3400型凝胶图像分析仪(美国Alpha Innotech公司)对胶片扫描和分析。每个实验重复3次。
1.6 统计学处理 数据以±s, 采用SSPS10.0进行单向方差分析，组间比较t检验。
2 结果
2.1 姜黄素对T24细胞增殖的影响 不同浓度的姜黄素分别作用T24细胞12、24、48、72h, 均能抑制细胞增殖。且具有量效关系和时效关系。与对照组比较(P<0.05)，见图1。
2.2 不同浓度的姜黄素作用T24细胞12h的p300、c?fos、c?jun的mRNA的表达 15、30、45 μmol/L
图1 姜黄素在体外对T24细胞的增值抑制作用
姜黄素作用T24细胞12h后，p300、c?fos、c?jun的mRNA表达明显受到抑制。各组与对照组相比都有显著差异，P<0.05。姜黄素对p300、c?fos、c?jun的mRNA的抑制作用具有浓度依赖性，见图2。
2.3 姜黄素对p300、乙酰化组蛋白H3、H4、p300、c?fos、c?jun的蛋白表达的影响 15、30、45μmol/L的姜黄素分别作用T24细胞24h后，呈浓度依赖性的抑制p300、乙酰化组蛋白H3和H4、c?fos、c?jun的蛋白的表达，与对照组比都有显著差异,P<0.05，见图3。
3 讨论
姜黄素的抗癌作用近来受到重视，资料显示，姜黄素能抑制实验动物乳腺癌、皮肤癌[2]的发生,显著减少肿瘤数目,缩小瘤体大小。姜黄素可显著降低小鼠膀胱移植癌的成瘤率[3]。而且姜黄素的毒副作用很小,是一种有广泛应用前景的抗癌新药。本实验结果表明姜黄素具有浓度依赖性和时间依赖性抑制T24细胞增殖的作用。报道，姜黄素可以调控原癌基因和抑癌基因的表达发挥抗癌作用，如下调NF?κB、c?myc、c?ras[4]的表达，上调p53,bax[5]表达，但是其机制不清楚。Karanam等[1]发现姜黄素能抑制p300/CBP的表达，同时抑制其组蛋白乙酰化酶活性，从而调节基因的表达。提示p300/CBP可能是姜黄素发挥抗癌作用的靶点之一。
哺乳动物p300蛋白是一种转录共激活因子，调控基因表达和信号传递，具有调节细胞增殖、分化和凋亡的作用。其机制可能是p300蛋白具有组蛋白乙酰化酶的活性，通过乙酰化组蛋白使染色体呈开放状态，基因的启动子暴露，便于基因的转录[6]。p300不仅能使组蛋白乙酰化,而且也可以使非组蛋白乙酰化，如p53、E2F?1、E2F?2、E2F?3、MYB等，调节其活性。p300还可以作为支架，将转录活性因子连接到转录装置上,形成转录复合物，调节基因的转录。p300可能是肿瘤和HIV的基因中的一个重要的靶点。本实验表明15、30、45μmol/L姜黄素能抑制T24细胞的p300 mRNA和蛋白的表达，且具有浓度依赖性，同时下调组蛋白H3、H4的乙酰化。
肿瘤的发生与癌基因的活化和抑癌基因的失活密切相关。c?fos和c?jun是核内癌基因,属于即刻早期基因，其蛋白形成c?fos / c?jun( AP?1)或c?jun / c?jun二聚体，启动一系列信号转导通路,使细胞增殖。c?fos和c?jun基因的转录活化需要组蛋白H3的乙酰化[7]。本实验显示，姜黄素可以抑制c?fos和c?jun在mRNA和蛋白水平表达，并与其下调p300的表达和组蛋白H3的乙酰化作用一致。推测姜黄素抑制p300表达和组蛋白乙酰化酶活性，进而抑制c?fos和c?jun的表达。进一步研究姜黄素抑制p300的表达和组蛋白乙酰化酶活性的作用对于研究姜黄素的抗癌作用有重要意义。
组蛋白的乙酰化和去乙酰化是一个动态的可逆过程，组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HADC）催化并调控这一过程。目前发现的真核转录相关HAT有Gcn5、p300/CBP、TAFⅡ250、MYST、PCAF等， 姜黄素对H3、H4乙酰化的抑制作用是否还和Gcn5、TAFⅡ250、MYST、PCAF有关值得研究。另外，姜黄素对c?ras、 bax等基因的调节是否和其抑制p300的途径有关，也有待研究。
【文献】
［1］ Karanam B, Radhika A. V, Mohammed A, et al.Curcumin, a Novel p300/CREB? binding Protein?specific Inhibitor of Acetyltransferase, Represses the Acetyl ?ation of Histone/Nonhistone Proteins and Histone Acetyl transferase?depend ent Chromatin Transc ription J/[J/]. Biol Chem, 2004,279(12):51163?51171.
/[2/] Limtrakul P, Lipigorngoson S, Namwong, et al. Inhibitory effect of dietary curcumin on skin carcinogenesis in mice/[J/].Cancer Lett, 1997, 116(2):197?203.
/[3/] Sindhwani P,Hampton J A,Baig M M,et al. Curcumin prevents intravesical tumor implantation of the MBT?2 tumor cell line in C3H mice/[J/].J Urol,2001,166(4):1498?1501.
/[4/] Limtrakul P P, Anuchapreeda S, Lipigorngoson S,etal. Inhibition of carcinogen induced c?Ha?ras and c?fos proto?oncogenes expression by dietary curcumin/[J/].BMC Cancer,2001,1(1):1.
/[5/] Choudhuri T, Pal S,Agwarwal M L,et al.Curcumin induces apoptosis in human breast cancer cells through p53?dependent Bax induction/[J/].FEBS Lett,2002,512(1?3):334.
/[6/] Dema rest SJ Martinez Yamout M,Chungk,et al.Mutual synergitic folding in recruitment of CBP/p300 by p160 nuclear receptor coactivators/[J/]. Nature, 2002,41（5）：549?553.
/[7/] Alison L,Clayton,Sally Rose,et al.Phosphoacetylation of histone H3 on c?fos and c?jun?associated nucleosomes upon gene activation/[J/].The EMBO Journal,2000, 19(14):3714?3726.
