hTERT短发夹状RNA抑制前列腺癌细胞生长的研究

         作者：平浩， 张军晖，陈晓春， 鲁功成

【摘要】  目的 研究靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹状RNA（shRNA）基因转染对前列腺癌细胞体外生长的抑制效应及其促细胞凋亡作用。 方法 在脂质体介导下将针对hTERT 基因的shRNA表达载体psilencer?TRT转染前列腺癌细胞PC?3m，得到稳定细胞株PC?3m/shRNA?TRT。采用RT?PCR检测hTERT基因表达情况，western blot分析各组细胞hTERT及c?myc蛋白表达变化，细胞计数并绘制细胞生长曲线，Hoechst33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 结果 重组质粒psilencer?TRT转录生成的shRNA使实验组细胞的hTERT基因表达显著下调，抑制率约为89.02%；同时实验组细胞hTERT及c?myc蛋白水平较对照组有明显下降，细胞的生长增殖能力也显著降低（P<0.05），生长速率明显变慢，部分细胞呈现凋亡形态学改变，凋亡率为(19.69±4.75)％。 结论 hTERT短发夹状RNA能有效抑制前列腺癌细胞中hTERT表达及癌细胞生长，诱导PC?3m细胞凋亡，可望为前列腺癌的基因提供新方法。

【关键词】  端粒酶逆转录酶； 短发夹状RNA； 前列腺癌； 凋亡

    RNA干扰是近几年发现和起来的一项新的基因阻断技术，由于其具有高效的抑制作用，已广泛应用于医学的多个领域[1]。人端粒酶逆转录酶基因编码的端粒酶催化亚单位在大多数肿瘤中表达上调并对肿瘤细胞的端粒酶活性起重要调控作用，是目前肿瘤基因治疗中一个极具前景的靶点[2]。因此，本研究拟通过转染针对端粒酶hTERT的siRNA表达载体，使其在前列腺癌细胞PC?3m内稳定产生特异性的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)，诱导RNA干扰，并探讨shRNA对hTERT、c?myc 表达及细胞增殖和凋亡的影响，寻找新的前列腺癌基因治疗方法。

    1  材料和方法

    1.1  材料与试剂

    质粒psilencer2.1?U6neo购自美国Ambion公司。AnnexinⅤ?FITC试剂盒购自晶美生物技术有限公司。

    1.2  shRNA表达载体的构建及鉴定

    本实验应用本组已成功构建的重组质粒psilencer?TRT[3]，其合成步骤大致如下：针对hTERT基因靶点（TTTCATCAGCAAGTTTGGA）合成两条寡核苷酸链，它包括两端的BamHI和HindIII酶切位点及反向的两个一致的靶序列，被9bp的非同源序列的环间隔，3’末端加有TTTTTT终止序列。该正反两条寡核苷酸链退火得到双链DNA，并将该退火siRNA目的片段插入到psilencer2.1?U6载体中，连接产物psilencer?TRT转化宿主菌DH5α并行测序鉴定；阴性对照质粒psilencer?NC由人和鼠的非同源性靶序列构建合成。

    1.3  细胞培养及稳定转染

    人前列腺癌细胞株PC?3m接种于6孔板，在含10%小牛血清的DMEM培养基中生长至50%～70%融合。采用脂质体转染法稳定转染抑制质粒psilencer?TRT和对照质粒psilencer?NC，按照转染试剂盒说明书提供的步骤进行，将重组质粒与脂质体1∶3混合，G418筛选阳性细胞克隆并进行实验分组，转染psilencer?TRT质粒的PC?3m细胞命名为PC?3m/shRNA?TRT（实验组），转染psilencer?NC质粒的PC?3m细胞命名为PC?3m/shRNA?NC（阴性对照组）。未转染质粒的亲本细胞PC?3m作为空白对照组。

    1.4  RT?PCR检测hTERT mRNA的表达水平

    收集细胞，提取细胞总RNA，MMLV逆转录酶进行反转录，相应PCR反应体系中进行扩增， PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线透射仪下观察拍照并行条带灰度分析，hTERT与β?actin灰度的比值即为hTERT mRNA相对量A值。

    抑制率＝A实验组/A阴性对照组×100%

    1.5  Western blot检测hTERT、c?myc蛋白表达

    收集细胞后加入预冷的裂解缓冲液，离心取上清，二喹啉甲酸法测定蛋白含量。以等量蛋白上样，在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，电转移法将蛋白质从SDS?PAGE凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜，室温封闭，并分别加入一抗及二抗，碱性磷酸酶系统显色，同时β?actin蛋白作为内参照。

    1.6  细胞生长曲线测定

    将PC?3m细胞及稳定表达G418抗性的转染细胞以1×104/ml的浓度接种于24孔板中，每隔24h对每组细胞的3个孔进行消化，显微镜下计数，取平均值，共测5个时间点，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线。

    1.7  荧光染色观察细胞凋亡

    采用Hoechst33258染色法观察凋亡细胞形态。培养后收集各组细胞， 4°C固定5min，加入Hoechst33258染色液（1∶20），荧光显微镜下观察拍照。

    1.8  透射电镜观察细胞形态

    收集细胞后，D?hanks缓冲液清洗2次，以2.5%戊二醛、1%锇酸双固定，常规电镜样品制备程序脱水、渗透、包埋，超薄切片，铀铅染色，透射电镜下观察照相。

    1.9  流式细胞仪检测细胞凋亡

    采用AnnexinⅤ?FITC和PI双染色流式细胞仪法，具体步骤按试剂说明书进行，流式细胞仪检测488nm波长处吸光度值。

    1.10  统计学方法

    应用SPSS11.5统计分析软件进行t检验。

    2  结果

    2.1  质粒psilencer?TRT的鉴定结果

    核酸序列分析结果可证实，shRNA表达载体psilencer?TRT构建成功，测序结果与设计的完全一致，见图1。

    2.2  各组细胞中hTERT mRNA表达水平

    琼脂糖凝胶电泳上，各组均可见明亮的内参照β?actin的扩增条带，空白对照组PC?3m细胞和阴性对照组PC?3m/shRNA?NC细胞hTERT条带较明亮，两者hTERT mRNA的量基本一致，hTRT/β?actin比值（A）分别为0.84±0.16和0.82±0.13，两者比较无显著性差异（P>0.05）；实验组PC?3m/shRNA?TRT细胞中hTERT mRNA表达水平明显降低，A值为0.09±0.04，抑制率为89.02%，与阴性对照组和空白对照组比较差异有显著性（P<0.01），见图2。

    1: DNA marker DL2000;  2: PC?3m;   3:PC?3m/shRNA?NC;  4:  PC?3m/shRNA?TRT

    图2  RT?PCR检测各组癌细胞hTERT mRNA水平

    2.3  各组细胞中hTERT及c?myc蛋白表达变化

    Western blot分析显示，空白对照组PC?3m细胞和阴性对照组PC?3m/shRNA?NC细胞均高表达hTERT及c?myc蛋白，蛋白条带清晰，两组间无明显变化。而实验组PC?3m/shRNA?TRT细胞中hTERT和c?myc蛋白水平有不同程度的降低，蛋白表达受到抑制，尤其以hTERT蛋白降低最为明显，见图3。

    1: PC?3m;  2: PC?3m/shRNA?NC;  3: PC?3m/shRNA?TRT

    图3  Western blot检测各组癌

    细胞hTERT及c?myc 蛋白表达

    2.4  细胞体外生长情况

    实验组PC?3m/shRNA?TRT细胞生长速度明显减慢，倍增时间延长，细胞增殖受到抑制（P<0.05）；而PC?3m/shRNA?NC细胞体外增殖活跃，与未转染PC?3m细胞相比增殖活性无明显改变（P>0.05），见图4。

    图4  hTERT短发夹RNA对PC?3m细胞增殖的影响

    2.5  细胞荧光染色结果

    部分PC?3m/shRNA?TRT细胞呈现凋亡特征性的形态学变化，细胞皱缩，染色强度增强，染色质凝集，核固缩并断裂成数个大小不等的圆形颗粒及凋亡小体；而PC?3m/shRNA?NC细胞及正常PC?3m细胞染色中细胞核荧光染色均匀，未见或少见凋亡细胞，见图5。

    2.6  凋亡细胞超微结构观察

    透射电镜观察结果显示，对照组细胞形态正常，结构完整。实验组可见部分PC?3m/shRNA?TRT细胞呈凋亡形态，细胞体积缩小，胞浆浓缩，染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状，出现核质沿核膜内侧排列的现象，见图6。

    2.7  细胞凋亡率检测

    分析流式细胞仪双参数图发现，PC?3m和PC?3m/shRNA?NC细胞均未见明显凋亡，凋亡率分别为(0.94±0.29)%、(1.37±0.68)%；PC?3m/shRNA?TRT细胞凋亡明显增加，凋亡率为(19.69±4.75)%，显著高于空白对照组和阴性对照组细胞(P<0.01)。

    3  讨论

    端粒酶是近年来肿瘤研究的热点之一，它由自身RNA模板（hTR）、端粒酶相关蛋白（TP?1）和端粒酶催化亚单位（hTERT）等部分组成，其异常激活可使细胞逃避衰老、死亡而发生永生化和癌变。已证实，hTERT基因在端粒酶阳性的永生化和肿瘤细胞中高表达，但在端粒酶阴性的绝大多数正常体细胞中不表达。研究发现，在前列腺癌中hTERT基因的阳性率可高达90%，hTERT表达与端粒酶活性密切相关，可能是端粒酶激活的限速步骤，其水平升高可能在前列腺癌的发生中起重要作用［4］。并且，hTERT的调控是非常复杂的过程，它受到细胞内多种因素的影响，其中c?myc/Max/Mad调节是一个重要环节［5，6］。 质粒psilencer?TRT瞬时转染前列腺癌细胞，明显降低了hTERT表达水平，并显著抑制端粒酶活性，从而证实了psilencer?TRT转录产生的shRNA对hTERT基因的强大沉默效应，为RNA干扰前列腺癌提供了基础［3］。目前，众多研究显示，抑制hTERT基因表达可选择性抑制肿瘤细胞中的端粒酶活性而导致抗肿瘤效应［7］。因此，本实验利用已构建的psilencer?TRT重组质粒稳定转染前列腺癌细胞PC?3m，得到稳定细胞株PC?3m/shRNA?TRT，检测发现其hTERT 基因表达显著降低，并且hTERT及c?myc蛋白水平明显下降，说明短发夹状RNA不但抑制了hTERT基因，而且对其调控蛋白c?myc也有抑制作用，也进一步证实了RNA干扰质粒具有稳定性好、抑制作用强、细胞摄取相对容易等多种特点。此外我们还发现，实验组的前列腺癌细胞体外生长缓慢，倍增时间延长，取对数生长期的PC?3m/shRNA?TRT细胞继续培养5天后，部分细胞发生凋亡，凋亡率可达19.69%，说明这种作用可能与细胞周期的改变、细胞端粒酶的调节和凋亡信号转导途径的激活有关。同时，结果间接提示了前列腺癌细胞内的hTERT基因受c?myc调节，c?myc可能通过激活hTERT的表达而导致肿瘤的发生，两者在细胞中过表达对于肿瘤的形成和发展具有重要作用［8］。

    目前，RNA干扰技术已广泛应用于基因功能、抗肿瘤和抗病毒基因等方面的研究，尤其是短发夹状RNA的应用，可以对基因表达产生稳定强大的干扰效应，为肿瘤的治疗提供了良好的前景［9］。在我们的研究中，我们采用短发夹状RNA表达质粒对肿瘤密切相关的靶基因hTERT进行干预，发现hTERT shRNA可逆转前列腺癌细胞的恶性表型，这种作用不仅与端粒酶活性的抑制有关，可能还涉及多种基因和信号途径的参与。因此，针对hTERT基因的RNAi技术有望成为前列腺癌治疗的新方法。

【】
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［3］ 平浩，陈晓春，叶哲伟，等. 短发夹状RNA对PC?3M细胞端粒酶逆转录酶基因表达和端粒酶活性的影响/[J/].临床泌尿外科杂志，2004，19(12)：743?746.

［4］ Bettendorf O, Heine B, Kneif S, et al. Expression?patterns of the RNA component (hTR) and the catalytic subunit (hTERT) of human telomerase in nonneoplastic prostate tissue, prostatic intraepithelial neoplasia, and prostate cancer/[J/]. Prostate, 2003, 55(2): 99?104.

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