胃癌中Cks1、p27Kip1和Skp2蛋白的表达
作者：赵勇， 高建飞，饶智国，欧武陵，朱宇泽，杜光祖
【摘要】 目的 探讨Cks1在胃癌发生及其在Skp2调节p27Kip1降解过程中的作用。方法 应用流式细胞术测定正常胃粘膜和胃癌组织中Cks1、p27Kip1、Skp2蛋白表达。结果 胃癌组织中Cks1、Skp2表达明显高于正常胃粘膜﹙χ2=22.69， Ｐ＜0.05；χ2=13.42, P＜0.05﹚，而p27Kip1表达则低于正常胃粘膜﹙χ2=14.83,P＜0.05﹚。胃癌中Cks1、Skp2表达与p27Kip1表达呈负相关﹙r=-0.649， P＜0.05；r=-0.732，P＜0.05﹚；而Cks1蛋白表达与Skp2蛋白缺乏相关性﹙P＞0.05)。胃癌中Cks1的表达与肿瘤分化程度相关（χ2=5.05, P＜0.05），而与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期不相关（P＞0.05）。结论 Cks1可能参与了胃癌的发生；胃癌中Cks1可能参与了Skp2调节p27Kip1泛素化降解过程。
【关键词】 胃肿瘤；Cks1蛋白； Skp2蛋白； p27Kip1 蛋白
许多恶性肿瘤中细胞周期性蛋白p27Kip1表达是降低的，F?box蛋白Skp2 ( S phase kinase protein 2，Skp2)参与了p27Kip1 泛素化降解过程。Cks1( Cyclin kinase subunit 1，Cks1)是高度保守的细胞周期调节蛋白Suc1/Cks家族成员之一，其在肿瘤组织中的作用及其与p27Kip1和Skp2的关联性尚不十分明确，我们用流式细胞仪检测正常胃粘膜和胃癌组织中Cks1、p27Kip1、Skp2的表达如下，以期对此问题找到解答。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
获取手术切除、经临床、病理证实的64例胃癌标本及20例正常胃粘膜组织。所有标本术前均未行放疗、化疗或免疫。胃癌患者中，男34例，女30例；年龄22～78岁，平均年龄54.7岁。TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期23例，Ⅲ期19例，Ⅳ期10例。分化程度：高分化17例，中分化19例，低分化18 例，未分化10例。癌转移情况：淋巴结转移31例，无淋巴结转移33例；远处转移10例，无远处转移54例。胃壁浸润深度：浸润未超过浆膜层（T1＋T2）32例，浸润超过浆膜层（T3＋T4）32例。Cks1兔抗人单克隆抗体及Skp2鼠抗人单克隆抗体购自美国ZYMED公司，p27Kip1鼠抗人单克隆抗体购自丹麦DAKO公司。
1.2 方法
手术切除的新鲜组织，取无出血区部分组织块，PBS洗净血迹，机械破碎法制成单细胞悬液。将细胞悬液0.5ml加入两只小试管，PBS液洗涤一次，离心，弃上清，试管内加入兔抗人Cks1（或p27Kip1、Skp2）荧光多克隆抗体10μl，对照试管加入PBS，混匀，4℃孵育30min，PBS洗涤一次，离心，清除多余未结合抗体后上机检测。每1标本检测10 000个细胞。Cks1（或p27Kip1、Skp2）阳性率=[试管中Cks1（或p27Kip1、Skp2）阳性细胞数－阴性对照阳性细胞数]/10 000×100%。设阳性率≥10%为阳性表达，阳性率≥30%为高表达[1]。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计分析软件进行χ2检验和Spearman等级相关分析，P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 Cks1、p27Kip1、Skp2的表达
胃癌组织中Cks1、Skp2阳性率明显高于正常胃粘膜组织(χ2= 22.69,P＜0.05；χ2=13.42, P＜0.05)，而p27Kip1阳性率则低于正常胃粘膜组织(χ2=14.83,P＜0.05),见表1。表1 Cks1、p27Kip1、Skp2在不同胃组织标本中的表达注：组间比较 P＜0.05 胃癌组织中Cks1表达与癌组织分化程度相关，低、未分化组Cks1表达阳性率明显高于高、中分化组(χ2=5.05, P＜0.05)，而与胃癌患者年龄、性别、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和临床分期不相关(P＞0.05）,见表2。
2.2 胃癌中Cks1表达与Skp2、p27Kip1的关联性
64例胃癌组织根据Cks1、Skp2蛋白表达情况分为三组：Cks1、Skp2同时高表达21 例；Cks1、Skp2同时低表达27 例；Cks1高表达、Skp2低表达或Cks1低表达、Skp2高表达16例。 21例Cks1、Skp2同时高表达者18例p27Kip1低表达； 27例 Cks1、Skp2同时低表达者23例p27Kip1高表达。胃癌组织中Cks1、Skp2表达均与p27Kip1蛋白表达负相关﹙r=-0.649, r=-0.732，P＜0.05﹚，但有6例Skp2蛋白与p27Kip1蛋白同时高表达，4例Skp2蛋白与p27Kip1蛋白同时低表达；而Cks1蛋白表达与Skp2蛋白缺乏相关性(P＞0.05)。
3 讨论
本研究显示胃癌组织中Skp2表达明显高于正表2 胃癌中Cks1表达与临床病理因素的关系 (%)
类别例数Cks1P年龄（岁） ＞603574.3(26/35) ≤602972.4(21/29)P＞0.05△性别 男3473.5(25/34) 女3073.3(22/30)P＞0.05△分化程度 高＋中分化3661.1(22/36) 低＋未分化2889.3(25/28)P＜0.05※侵袭深度 T1＋T23271.2(23/32) T3＋T43275.0(24/32)P＞0.05△淋巴结转移 有3177.4(24/31) 无3369.7(23/33)P＞0.05△临床分期 Ⅰ+Ⅱ3568.6(24/35) Ⅲ+Ⅳ2979.3(24/35)P＞0.05△
组间比较△P>0.05,※ χ2=5.05,P＜0.05常胃粘膜，而p27Kip1表达则低于正常胃粘膜；胃癌组织中Skp2蛋白与p27Kip1蛋白负相关。这一结果支持p27Kip1、Skp2参与了胃癌的发生及Skp2参与了p27Kip1泛素化降解过程的推论。但本实验还发现10例Skp2，p27Kip1同时高表达或Skp2，p27Kip1同时低表达。Dowen等[2]发现50%的宫颈癌组织中p27Kip1，Skp2同时高表达或低表达。Hara T[3]等发现在缺乏Skp2的胞浆内，仍可检测到p27Kip1的泛素化活动，说明细胞浆内可能存在p27Kip1其他泛素化过程。
Sitry等[4]研究表明，无论在体内或体外，Skp2只有结合Cks1后才能识别p27Kip1进行泛素化蛋白降解。本研究发现Cks1、Skp2同时高表达者p27Kip1低表达；Cks1、Skp2同时低表达者p27Kip1高表达，Cks1、Skp2表达均与p27Kip1蛋白表达负相关， 这说明Cks1、Skp2可能共同参与了p27Kip1的泛素化降解过程。Kitajima等[5]发现将Cks1、Skp2单独转染细胞时Cks1并不能使p27Kip1的水平下降，而Cks1、Skp2同时转染细胞可致p27Kip1降解，通过siRNA抑制Cks1的表达可使p27Kip1表达增加，并可抑制肿瘤细胞生长。而Masuda等[6]研究发现Cks1、Skp2同时转染细胞并不使p27Kip1mRNA水平降低，而是降低了p27Kip1蛋白水平，这再次证明了Cks1、Skp2可能共同参与了p27Kip1蛋白的泛素化降解过程。
本研究发现胃癌组织中Cks1表达明显高于正常胃粘膜， Cks1的表达与肿瘤分化程度相关，这说明Cks1可能参与了胃癌的发生，Cks1蛋白表达增多，使得胃癌细胞脱离了原有的正常生长周期调控，呈无节制生长状态，Cks1表达越多，细胞分化程度越低，肿瘤恶性程度越高，或许可作为预后不良的指标，但我们发现其与临床分期和淋巴结转移不相关，可能由于Cks1在胃癌中的表达和生物学效应与多种因素有关，且在胃癌进展过程中还受其他多种基因的调控，是多基因、多因素共同作用的结果，故仅Cks1指标，并不能反映胃癌浸润及转移的情况。
【参考】
［1］ Shapira M, Ben?Izhak O, Linn S, et al. The prognostic impact of the ubiquitin ligase subunits Skp2 and Cks1 in colorectal carcinoma /[J/]. Cancer, 2005,103(7):1336?1346.
/[2/] Dowen SE , Scott A, Muknerjee G, et al. Overexpression of Skp2 in carcinoma of the cervix does not correlate inversely with p27 expression /[J/]. Int J Cancer, 2003, 105(3): 326?330.
/[3/] Hara T, Kamura T, Nakayama K, et al. Degradation of p27(Kip1) at the G(0)?G(1) transition mediated by a Skp2?independent ubiquitination pathway /[J/]. Biol Chem, 2001, 276(52): 48973?48942.
/[4/] Sitry D, Seeliger MA, Ko K, et al. Three different binding sites of Cks1 are required for p27?ubiquitin ligation /[J/]. J Biol Chem, 2002, 277(44): 42233?42240.
/[5/] Kitajima S, Kudo Y, Ogawa I, et al. Role of Cks1 overexpression in oral squamous cell carcinomas: cooperation with Skp2 in promoting p27 degradation/[J/]. Am J Pathol, 2004, 165(6):2147?2155.
/[6/] Masuda TA, Inoue H, Nishida K, et al. Cyclin?dependent kinase 1 gene expression is associated with poor prognosis in gastric carcinoma/[J/]. Clin Cancer Res, 2003,9(15):5693?5698.
