甘草酸诱导人乳腺癌细胞凋亡和细胞内Ca2＋的关系
【关键词】 甘草酸 人乳腺癌细胞（MCF?7 凋亡 细胞内Ca2+
甘草酸（Glycyrrhizin，GL）是甘草中最重要的有效成分之一，有研究[1,2]表明甘草酸对人癌细胞增殖有明显的抑制和诱导其凋亡的作用。本研究即探讨甘草酸诱导人乳腺癌细胞（MCF?7）凋亡与细胞内Ca2＋浓度变化的关系。
1 材料与方法
1.1 细胞株 MCF?7由美国引进[2]；甘草酸单胺（纯度99.7%） 浙江强力宁制药公司研究所产品。
1.2 细胞增殖抑制测定 用MTT比色法测定。
1.3 细胞凋亡测定 用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP末端标记法、Annexin V流式细胞仪法和单细胞凝胶电泳（彗星试验）法检测凋亡细胞。7.5mmol/L甘草酸处理细胞24h，用Fura?2荧光负载方法[3]测定[Ca2+]i的变化。
1.4 统计学方法 t检验，半增殖抑制浓度（IC50）用加权直线回归法。
2 结果
2.1 甘草酸对MCF?7细胞增殖抑制作用 从5mmol/L甘草酸浓度起对细胞的增殖抑制作用出现显著性差异(P<0.01)，且抑制程度呈剂量依赖性，IC50为15.84mmol/L。其中5mmol/L、7.5mmol/L和10mmol/L甘草酸的增殖抑制率分别为22.5%、32.9%和40.2%（P<0.01），这些浓度被选定为凋亡试验的药物浓度，见图1。表1 甘草酸对MCF?7细胞凋亡的诱导作用与对照组比较：△P>0.05，*P<0.05，**P<0.01
2.2 甘草酸对 MCF?7细胞凋亡的诱导作用 用选定的甘草酸浓度处理MCF?7细胞24h后，检测的细胞凋亡结果见表1，可见7.5mmol/L和10 mmol/L甘草酸使细胞凋亡率明显增加（P<0.01和P<0.05），并呈剂量依赖性。在同等浓度作用下，三种方法检测的结果相差不大。
2.3 甘草酸诱导MCF?7细胞凋亡时[Ca2+]i的变化 7.5mmol/L甘草酸处理MCF?7细胞24h后，测得甘草酸处理组[Ca2+]i为(58.59±1.03)nmol/L，对照组[Ca2+]i为(129.17±11.45) nmol/L，甘草酸处理组[Ca2+]i显著低于对照组（P<0.05）。
2.4 细胞内Ca2+螯合剂阻遏甘草酸诱导MCF?7细胞凋亡的作用 用100μmol/L细胞内Ca2+螯合剂BAPTA?AM和7.5mmol/L甘草酸组合处理MCF?7细胞24h后，单细胞凝胶电泳法检测的凋亡结果见表2，组合处理组的凋亡率明显低于单纯的7.5mmol/L甘草酸处理组（P<0.05）。表2 细胞内Ca2+螯合剂阻遏诱导MCF?7细胞凋亡的作用 与对照组比较：△P>0.05，*P<0.05
3 讨论
本研究结果显示甘草酸具有抑制人乳腺癌MCF?7细胞增殖的作用。癌细胞增殖抑制可由多种机制导致，其中癌细胞发生凋亡是近年来人们关注的热点。本研究用碱性单细胞凝胶电泳法检测得到的凋亡率，与检测反映早期凋亡特征的细胞膜外翻的磷脂酰丝氨酸的Annexin V流式细胞仪法、以及与高灵敏度检测中、晚期凋亡的特征即凋亡细胞DNA断裂的TUNEL法所得的结果有明显的一致性。结果显示，三种方法测定的在同等甘草酸浓度作用下的凋亡率基本相等，这可能反映甘草酸诱导凋亡细胞发生DNA断裂的速率很快。另外，甘草酸诱导MCF?7细胞凋亡的凋亡率，只略低于相应甘草酸浓度作用的细胞增殖抑制率，可见甘草酸诱导凋亡的作用在抑制MCF?7细胞增殖中起重要作用。目前，多数[3,4]报道细胞内Ca2+水平升高与诱发细胞凋亡密切相关，而Kluck等[5]和Bansal等[6]用EGTA等Ca2+络合剂处理NS?1鼠骨髓瘤细胞和CEM?C7人T淋巴细胞，发现[Ca2+]i下降伴随细胞凋亡发生，他们认为[Ca2+]i下降抑制DNA和蛋白质合成，影响许多Ca2+依赖性的蛋白质活性、细胞活动和基因表达等。本研究结果显示甘草酸诱导人乳腺癌MCF?7细胞凋亡组的细胞内Ca2+水平明显低于对照组，这一结果与Kluck等[5]和Bansal等[6]报道相符，我们推测甘草酸诱导乳腺癌MCF?7细胞凋亡可能与细胞内Ca2+水平降低有关。但是通过细胞内Ca2+螯合剂BAPTA?AM络合细胞内游离Ca2+而减弱18β?甘草次酸对MCF?7细胞凋亡的诱导作用，这表明甘草酸诱导MCF?7凋亡并不全依赖于细胞内Ca2+水平下调，可能还与其他诱导癌细胞凋亡的信息传递途径有关，具体甘草酸诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚有待进一步探讨。
【文献】
［1］ Malagoli M, Castelli M, Baggio A, et al．Effect of glycyrrhizin and its diastereoisomers on the growth of human tumor cells: Preliminary finding /[J/]．Phytother Res, 1998, 12(1):S95?S97．
/[2/] 黄炜，黄济群，张东方，等．全反式维甲酸、18β?甘草次酸和甘草酸诱导人肝癌细胞分化和凋亡的研究/[J/]．中西医结合肝病杂志，2003，13(3):148?150．
/[3/] Grynkiewicz G, Poene M,Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties /[J/]. J Biol Chem, 1985, 260(3):3440?3450.
/[4/] Mattana A, Tozzi MG, Costa M, et al. By releasing ADP, Acanthamoeba castellanii causes an increase in the cytosolic free calcium concentration and apoptosis in wish cells /[J/]. Infect Immun, 2001, 69(6):4134?4140.
/[5/] Kluck RM, McDougall CA, Harmon BV, et al. Calcium chelators induce apoptosis??evidence that raised intracellular ionised calcium is not essential for apoptosis /[J/]. Biochim Biophys Acta, 1994, 1223(2): 247?254.
/[6/] Bansal N, Houle AG, Melnykovych G. Dexamethasone?induced killing of neoplastic cells of lymphoid derivation: lack of early calcium involvement /[J/]. J Cell Physiol, 1990, 143(1): 105?109.
