XPC基因多态性与食管鳞状细胞癌、贲门腺癌的发病风险

               作者：郭炜，周荣秒，李琰，王娜，万玲玲

【摘要】  目的 探讨DNA修复基因XPC第9内含子PAT+/-和第15外显子A2920C 单核苷酸多态性（SNP）与河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县人群食管鳞状细胞癌（ESCC）和贲门腺癌（GCA）遗传易感性的关系。方法 采用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性（PCR?RFLP）分析方法检测327名ESCC患者、253名GCA患者和612名健康对照个体的XPC基因第9内含子PAT+/-及第15外显子A2920C SNP的基因型，比较各组间等位基因及基因型频率的分布。结果 XPC基因第9内含子PAT+/-和第15外显子A2920C的基因型及等位基因型频率在ESCC患者组、GCA患者组和对照组之间，其总体分布均无显著性差异（P>0.05）。根据吸烟状况和上消化道肿瘤家族史分层分析发现，与A/A基因型比较，携带C/C基因型可能增加非吸烟个体ESCC的发病风险 （经性别、年龄和上消化道肿瘤家族史校正后的OR=2.09，95%CI=1.14～3.81）。结论 XPC基因第15外显子C/C基因型可能是影响河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县非吸烟人群ESCC发病风险的因素之一。

【关键词】  食管鳞状细胞癌；贲门腺癌；XPC；基因多态性；肿瘤易感性

　　Correlation of XPC Polymorphisms to the Risk of Esophageal Squamous Cell Carcinoma and Gastric Cardiac Adenocarcinoma

　　Abstract：Objective  To investigate the correlation of XPC intron 9 PAT+/- and exon 15 A2920C SNPs with susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and gastric cardiac adenocarcinoma (GCA) in a population of high incidence region of Hebei Province. Methods  XPC intron 9 PAT+/- and exon 15 A2920C SNPs were genotyped by polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphism (PCR?RFLP) analysis in 327 ESCC patients, 253 GCA patients and 612 healthy controls. Results  The overall genotype and allelotype distributions of XPC intron 9 PAT+/- and exon 15 A2920C in ESCC and GCA patients were not significantly different from that in healthy controls（P>0.05）. When stratified for smoking status and UGIC family history, compared with A/A genotype, C/C genotype significantly increased the risk of developing ESCC in non?smoker group [age and gender and UGIC family history adjusted odds ratio (OR)=2.09, 95%CI=1.14～3.81]. Conclusion  C/C genotype of XPC exon 15 may be one of the factors that affect the risk of developing ESCC in non?smoking population in the high incidence region of Hebei Province.

　　Key words：Esophageal squamous cell carcinoma；Gastric cardiac adenocarcinoma；XPC；Polymorphism; Susceptibility

　　0  引言

    XPC基因定位于染色体3p25，包括16个外显子和15个内含子，编码一个含940个氨基酸的蛋白质，其第9内含子和第15外显子均存在单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）[1]。XPC蛋白是着色性干皮病基因C的产物，对于维持基因组的稳定和完整性相当重要，其功能异常可导致DNA修复能力下降，因此与疾病易感性有关[2?4]。
    XPC第9内含子PAT+/-SNP、第15外显子A2920C SNP与头颈部、肺等多个部位肿瘤的发病风险关系已有报道[5?12]，但是，XPC基因多态性与食管癌、贲门癌发病风险的关联研究尚未见报道。本研究应用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性（Polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphism, PCR?RFLP）分析方法，探讨河北省食管癌、贲门癌高发区?磁县和涉县人群XPC基因第9内含子PAT+/-及第15外显子A2920C SNP对食管鳞状细胞癌、贲门腺癌易感性的影响。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象 

　　327名食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)患者、253名贲门腺癌(Gastric cardiac adenocarcinoma, GCA)患者均来自河北省食管癌、贲门癌高发区磁县和涉县的癌前普查，612名健康对照为在相同地区同一时间通过癌前普查获得，所有研究对象均知情同意本项研究，由专门的登记员调查所有研究对象的性别、年龄、吸烟史及上消化道肿瘤家族史。现吸烟或曾吸烟每天5支以上并持续2年或2年以上者定义为吸烟个体。家族中有1名以上一级亲属和（或）2名以上二级亲属患有食管癌、贲门癌、胃癌者定义为上消化道肿瘤（Upper gastrointestinal cancer, UGIC）家族史阳性。

　　1.2  标本采集及外周血白细胞DNA的提取 

　　所有研究个体均采集静脉血5ml，经枸橼酸钠抗凝，4℃冰箱保存。采血后一周内，以蛋白酶K消化?饱和氯化钠盐析法[13]提取外周血淋巴细胞染色体DNA。

　　1.3  XPC SNP基因分型 

　　XPC基因第9内含子基因型检测应用PCR方法进行。上游引物为5′?TAGCACCCAGCAGTCAAAG?3′，下游引物为5′?TGTGAATGTGCTTAATGCTG?3′。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳，突变基因型PAT+/+为344bp，野生基因型PAT-/-为266bp，杂合子PAT+/-基因型为344bp和266bp，见图1。

    XPC基因第15外显子基因型检测应用PCR?RFLP方法进行。PCR反应上、下游引物分别为5′?GGAGGTGGACTCTCTTCTGATG?3′和下游引物5′?TAGATCCCAGCAGATGACC?3′。PCR产物经限制性内切酶PvuⅡ（Takara）于37℃酶切16h后，进行2%琼脂糖凝胶电泳。突变基因型C/C存在PvuⅡ的识别位点产生582bp和183bp两条DNA片段，而野生基因型A/A缺乏PvuⅡ的识别位点保持原有PCR后的765bp的片段，杂合子A/C基因型则表现为765bp、582bp和183bp三条片段，见图2。
   
　　为进行基因型检测的质量控制，每一批PCR反应均以灭菌蒸馏水替代模板DNA作为阴性对照，XPC第9内含子的扩增产物随机挑取各基因型1例进行测序，而XPC第15外显子随机挑取10%进行重复实验。

　　1.4  统计学方法 

　　经卡方检验比较基因型频率的观察值与预期值，进行Hardy?Weinberg平衡分析。病例组和对照组的XPC基因型及等位基因型分布比较采用行×列表的卡方检验进行。应用非条件Logistic回归模型多因素（性别、年龄、吸烟、上消化道肿瘤家族史）校正相对风险度的比值比（Odds ratio，OR）及其95%可信区间CI。P<0.05为有统计学意义。分别应用EH软件和2LD软件进行单体型和连锁不平衡分析。统计分析采用SPSS11.5软件包进行。

　　2  结果

　　2.1  一般特征 

　　ESCC患者组、GCA患者组与对照组之间的性别、年龄构成相似（P>0.05）。ESCC患者组、GCA患者组中吸烟个体比例与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。ESCC患者组、GCA患者组中UGIC家族史阳性个体比例分别为48.0%、47.8%，显著高于对照组34.2%，表明UGIC家族史可能增加ESCC和GCA的发病风险（经性别、年龄和吸烟状况校正后的OR=1.80和1.75，95%CI=1.36～2.38和1.29～2.36），见表1。表1  食管癌、贲门癌和对照组人口学分布及XPC PAT+/-和A2920C等位基因型频率（略）

    所有标本均成功进行了基因型分型，测序及所有重复分型结果均与原结果相符。经卡方检验，XPC第9内含子及第15外显子SNP基因型分布均符合Hardy?Weinberg平衡（P>0.05）。

　　2.2  XPC基因第9内含子PAT+/- SNP与ESCC、GCA发病风险的关系 

　　XPC基因第9内含子PAT?和PAT+的等位基因频率及PAT-/-、PAT+/-、PAT+/+基因型频率在ESCC、GCA及对照组之间无显著性差异（P>0.05），见表1、2。按吸烟状况和上消化道肿瘤家族史进行分层分析，未发现XPC基因第9内含子PAT+/- SNP影响ESCC和GCA的发病风险，见表2。表2  XPC PAT+/- SNP 与ESCC、GCA发病风险的相关性分析（略）表3  XPC A2920C SNP 与ESCC、GCA 发病风险的相关性分析（略）

　　2.3  XPC基因第15外显子A2920C SNP与ESCC、GCA发病风险的关系 

　　XPC基因第15外显子A和C等位基因频率及A/A、A/C、C/C基因型频率在ESCC、GCA患者组与对照组之间无显著性差异，见表1、3。按吸烟状况和上消化道肿瘤家族史进行分层分析发现，在非吸烟组中ESCC患者的C/C基因型频率（14.6%）明显高于对照组（8.7%），与A/A基因型比较，携带C/C基因型可能增加非吸烟组ESCC的发病风险（经性别、年龄和上消化道肿瘤家族史校正后的OR=2.09，95%CI=1.14～3.81，见表3。

　　2.4  XPC基因第9内含子PAT+/-及第15外显子A2920C SNP单体型分布 

　　应用EH软件和2LD软件对XPC基因第9内含子PAT+/-及第15外显子A2920C SNP位点进行的联合分析显示，XPC基因第9内含子PAT-等位基因和第15外显子A等位基因存在连锁不平衡现象（D′=0.967348）。XPC A/-、A/+、C/-、C/+四种单体型，在ESCC、GCA患者组与对照组之间分布无显著性差异（P>0.05）。与A/-单体型比较，A/+、C/-、C/+单体型均未显著增加ESCC、GCA的发病风险，见表4。表4  XPC PAT+/-和A2920C SNP单体型频率与ESCC、GCA发病风险（略）

　　3  讨论

    内源性和（或）外源性的诱变因素可损伤细胞的DNA，如果损伤不能修复，可能导致程序性细胞死亡或无节制的细胞增殖和肿瘤的发生。不同类型的DNA损伤修复由不同的修复途径完成，核苷酸切除修复途径可修复嘧啶二聚体或其他光合物、化学加合物和交联，但个体间的DNA修复能力存在一定差异，其差异可能与DNA修复基因的单核苷酸多态性密切相关[5]。XPC基因是核苷酸切除修复系统的重要组成成分。

    有研究报道XPC基因第9内含子PAT+/+基因型可增加头颈部鳞状细胞癌和皮肤黑色素瘤的发病风险[5，6]；Nelson等[7]报道PAT+/+基因型减少了皮肤鳞状细胞癌的发病风险，与基底细胞癌的发病风险无关。关于XPC基因 PAT+/- SNP与肺癌发病风险的关系，结果则很不一致，Marin等[8]报道PAT+/+基因型增加了肺癌的发病风险；Lee等[9]报道PAT+/+基因型减少了小细胞肺癌的发病风险；人群则报道PAT+/-多态与肺癌发病风险无关[10]。我们的研究结果提示PAT+/-多态与ESCC、GCA发病风险无关。关于XPC基因第15外显子A/C多态与肿瘤发病风险关系的研究结果也不一致，Blankenburg等[6]报道C等位基因增加了皮肤黑色素瘤的发病风险；Sanyal等[11]报道C等位基因增加了膀胱癌的发病风险；Lee等[9]报道C/C基因型减少了小细胞肺癌的发病风险；Forsti等[12]报道C/C基因型与乳腺癌发病风险无关。诸多研究结果的分歧提示XPC基因多态性针对不同部位的肿瘤可能起不同的作用，而且研究人群种族的不同对研究结果也有一定的影响，进一步提示进行大样本基础人群病例对照研究的重要性。

    体外研究表明，XPC基因第15外显子A、C等位基因修复能力无显著性差异[4]，但是，XPC基因第15外显子C与第9内含子PAT+及第11内含子A存在连锁不平衡，而第11内含子为A/A基因型的XPC蛋白遗漏第12外显子区的几率比C/C基因型的XPC蛋白大2.6倍[4]，XPC蛋白第12外显子区是HHR23B蛋白的结合部位[4]，故遗漏第12外显子区的XPC蛋白不能与HHR23B蛋白结合，则XPC?HHR23B复合体不能形成，进而影响DNA损伤识别及损伤DNA的修复。因此，XPC基因第15外显子为C/C基因型的个体可能增加ESCC的发病风险。环境因素和遗传因素均影响个体肿瘤的发病风险，吸烟是引起食管癌、贲门癌的主要环境因素，我们的研究结果提示XPC第9内含子PAT+/+基因型、XPC第15外显子C/C基因型增加非吸烟组个体ESCC的发病风险，由于已排除吸烟因素的影响，考虑是否遗传因素在发病风险中发挥主要作用，但是，其生物学方面的确切机制尚需要进一步研究。
   
　　本研究结果还显示XPC基因第9内含子PAT-等位基因与第15外显子A等位基因存在连锁不平衡，可为我们以后疾病的基因诊断和基因提供一些思路。因为此类研究多是回顾性研究，且研究人群存在地区、人种和样本量的差异，因此有待于扩大样本量并在同种族、同地域人群中进行长期随访研究，并进一步观察XPC基因多态性与环境因素及其他遗传因素的相互作用，对揭示XPC基因多态性与肿瘤的确切关系有重要意义。

【】
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