体外构建的HTA?HSP70BCG冲激的树突状细胞疫苗的抗肿瘤作用
作者：孙光，郭连英，沈洁，刘丹丹，施广霞，钱振超
【摘要】 目的 观察体外构建的榄香烯复合瘤苗抗原?卡介苗热休克蛋白70复合物（HTA?HSP70BCG）诱导的树突状细胞疫苗的抗肿瘤效应。方法 来源于小鼠的肝癌Hca?F榄香烯复合疫苗的抗原（HTA）与卡介苗来源的HSP70（HSP70BCG）在体外构建成HTA?HSP70BCG复合物，用GM?CSF和IL?4诱导树突状细胞（DCs），分别用HTA?HSP70BCG、HTA和HSP70BCG对其冲激。用MTT 法检测该DCs刺激的全脾细胞的增殖活性及被刺激的脾细胞的细胞毒活性。用流式细胞仪检测DCs表面CD86和CD40的表达。结果 体外构建HTA?HSP70BCG可以诱导DCs成熟，表现为DCs表达CD86和CD40上调，该DCs可以刺激全脾细胞增殖并使其产生特异性杀瘤活性，其强度明显大于HTA。结论 体外构建HTA?HSP70BCG复合物可以诱导DCs成熟，该DCs可以激活脾细胞产生较强的特异性抗瘤效应。
【关键词】 热休克蛋白70；树突状细胞；肿瘤瘤苗；抗瘤效应
基金项目：部高等学校骨干教师资助计划
Antitumor Effects Induced by Dendritic Cell Vaccine Pulsed with HTA?HSP70BCG Complex Reconstituted in Vitro
Abstract：Objective To investigate antitumor effects induced by dendritic cells (DCs) pulsed with complex of tumor antigen from elemene?combo tumor cell vaccine?heat shock protein 70 of BCG (HTA?HSP70BCG).Methods Tumor antigen peptides from elemene?combo Hca?F cell (HTA) combined with HSP70BCG into HTA?HSP70BCG in vitro. DCs were induced in medium with GM?CSF and IL?4 and pulsed with HTA?HSP70BCG, HTA and HSP70BCG, respectively. The proliferation stimulating effects on un?separated splenocytes and the cytotoxicity of the splenocytes activated with DCs were evaluated with MTT assay. The expression of CD40 and CD86 on the surface of DCs was assessed by flow cytometer.Results Pulsing of HTA?HSP70BCG resulted in DCs maturation, characterized by up?regulation of CD86 and CD40. Proliferation index of un?separated splenocytes from HTA?HSP70BCG group was significantly increased as compared with HTA group. Un?separated splenocytes from DCs pulsed with HTA?HSP70BCG revealed the cytotoxicity agaist Hca?F, The HTA failed to reveal the cytotoxicity against Hca?F.Conclusion HTA?HSP70BCG could induce DCs maturation and the mature DCs could activate splenocytes to generate more potent specific antitumor effect.
Key words：Heat shock protein70； Dendritic cell； Tumor vaccine；Antitumor effects
0 引言
热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是细胞受到应激时新合成或合成增加的一组蛋白质，被称为分子伴侣，在细胞抗原的加工和提呈方面起重要作用［1］。分枝杆菌HSPs与相关抗原形成融合蛋白可诱导特异性T细胞反应，分枝杆菌HSP70富含T、B细胞表位，是细胞免疫的重要靶点，可被用来作为疫苗的载体［2］。现已证明，从肿瘤细胞来源的HSPs?肿瘤肽复合物可诱导抗肿瘤免疫应答［3，4］，HSP70BCG能通过树突状细胞（Dendritic cell，DC）表面TLR4途径诱导DC成熟［5］。本实验采用榄香烯处理的Hca?F肿瘤抗原（Tumor antigen of Hca?F treated with elemene，HTA）在体外与卡介苗热休克蛋白70（HSP70BCG）构建成肿瘤疫苗HTA?HSP70BCG，探讨其抗瘤效应及机制。
1 材料
1.1 实验动物与瘤株
BALB/C近交系小鼠，引自医学院北京药物研究所。Hca?F肝癌细胞株由本校凌茂英教授惠赠。L929小鼠成纤维细胞瘤细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所张友会教授惠赠。
1.2 主要试剂
RPMI 1640（GIBCO，USA）；胎牛血清、rm?IL?4、rm?GM?CSF（Sigm）；FITC?抗小鼠CD40、PE?抗小鼠CD86抗体（San Diego，CA）；ADP( Trinity Biotech，Ireland)。
2 方法
2.1 HTA?HSP70BCG的体外构建
按本室常规方法制备榄香烯复合瘤苗，细胞浓度调至1×108/ml，用电动匀浆器研磨制成细胞匀浆，超速离心100 000g，取上清组分作为粗制肿瘤抗原（HTA）。超声碎BCG菌，超速离心后取上清，用ADP亲和层析法［6］分离卡介苗HSP70，提取物经SDS?PAGE电泳和Western blot 鉴定。分别用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。按比例将两类成分混合加ADP，使之相互作用形成复合物。
2.2 DC的诱导及冲激
按本室常规方法获得小鼠骨髓细胞，用含15%胎牛血清的RPMI 1640（含20ng/ml IL?4和20ng/ml GM?CSF）培养液将其浓度调到1×106/ml，在37℃、5%CO2条件下培养，第3天换液，第6天收集不粘附细胞为骨髓树突状细胞 (不成熟树突状细胞),将其浓度调至1×106/ml，分别加入HSP70BCG、HTA、HTA? HSP70BCG至终浓度25μg/ml，培养24h，收集细胞做细胞表型分析和冲激全脾细胞。
2.3 DC对全脾细胞的刺激作用
按本室常规方法获取全脾细胞，全脾细胞浓度调至4×106/ml，不同处理的DC浓度为4×105/ml，各取100μl加入96孔板培养，于72h以MTT法测定增殖活性，以刺激指数为指标，其公式为：刺激指数（SI）=实验组OD595/对照组OD595
2.4 刺激后的脾细胞的细胞毒活性
将不同处理的DC（浓度为4×105/ml）与全脾细胞（浓度为4×106/ml）共同培养5天，收集该细胞为效应细胞,细胞浓度调为4×106/ml，以Hca?F、L929为靶细胞，细胞浓度调为4×105/ml，各取100μl加入96孔板（E∶T=10∶1），并设单纯效应细胞和靶细胞组，培养72h，在终止实验前4h，加MTT（5μg/ml）20μl，于OD595测光密度值，计算细胞毒效应：细胞毒效应（%）=〔1-（ODE+T-ODE/ODT）〕×100%
2.5 统计学处理
实验数据均用(±s)表示，采用SPSS11.5软件处理，进行t检验。
3 结果
3.1 DC经HSP70BCG、HTA 、HTA? HSP70BCG冲激后表型的变化
骨髓细胞经GM?CSF和IL?4诱导6天获得DC（不成熟DC），该DC经HSP70BCG和HTA?HSP70BCG冲激后，其表面CD86、CD40表达上调，但HTA冲激仅CD86上调，对CD40影响不大,见图1。
CD40+ cells are in the upper right quandrant；
CD86+ cells are in the upper left and right quandrants.图1 DCs的CD86和CD40的表达
3.2 冲激后的DC对脾淋巴细胞的刺激作用
将不同DC与小鼠脾淋巴细胞培养3天，HTA?HSP70BCG和HSP70BCG冲激的DC加脾细胞组的增殖指数大于HTA冲激的DC加脾细胞组（P＜0.05），见表1。表1 全脾细胞与不同DC培养72h时的细胞增殖活性测定（略）
3.3 刺激后脾细胞的细胞毒作用
脾淋巴细胞经HTA冲激的DC刺激后，对 Hca?F和L929细胞无明显杀伤作用（与各自对照相比P＞0.05），HSP70BCG冲激的DC致敏的脾淋巴细胞均能杀伤Hca?F和L929细胞（与各自对照相比P＜0.01）。而经HTA?HSP70BCG复合物冲激的DC刺激的脾细胞对Hca?F细胞有较强的杀瘤活性（与对照和HTA相比P＜0.01），对L929细胞仅有微弱的杀伤活性（与对照和HTA相比P＜0.05），见表2。表2 DC刺激的全脾细胞的细胞毒作用（略）
4 讨论
肿瘤细胞由于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)?Ⅰ类分子表达低下及共刺激分子的缺乏，导致自身提呈抗原能力低下，肿瘤特异性T细胞的激活必需依赖于抗原提呈细胞的帮助。DC是体内最重要的抗原提呈细胞，能够有效摄取、加工肿瘤抗原，再经MHC?Ⅰ类分子、MHC?Ⅱ类分子提呈给T细胞使之激活，产生特异性的抗肿瘤免疫反应［7］，它在免疫系统中占有中心枢纽的作用［8］。肿瘤抗原肽是一类小分子物质，难以被DC捕获。热休克蛋白作为一种分子伴侣，可以结合抗原肽，在DC膜表面有其高亲和力受体，可将抗原肽提呈给DC［9］。这些发现为在体外构建肿瘤抗原肽—热休克蛋白疫苗提供了理论基础。
我们从榄香烯处理的Hca?F肝癌细胞提取肿瘤抗原（HTA），从卡介苗中提取HSP70（HSP70BCG），根据HSP70与蛋白质/多肽结合与解离的特性，在HTA与HSP70BCG混合物中加入ADP使它们形成HTA?HSP70BCG复合物，以期HSP70BCG能将HTA提呈给DC，再由DC将HTA加工、处理后提呈给T细胞，并使之激活，产生特异性杀瘤效应。结果显示，HTA与HSP70BCG结合成复合物HTA?HSP70BCG后，可以诱导DC成熟，表现为CD86和CD40的上调，该DC可进一步活化淋巴细胞，使淋巴细胞产生增殖反应并诱导出杀瘤活性，在体外证实了HTA?HSP70BCG抗肿瘤的有效性。选择肿瘤抗原肽携载物具有重要意义，HSPs是一组进化上高度保守的蛋白质，是病原微生物的重要抗原之一，可为宿主的免疫系统识别，是一个较为理想的抗原肽携载物。卡介苗（BCG）在临床上早已广泛用于结核病的预防和肿瘤的非特异性免疫，其安全性和有效性均有保障，因而HSP70BCG优于其他微生物来源的HSPs。HSP70BCG组淋巴细胞对Hca?F和L929细胞均产生较强的细胞毒性，其机制可能在于HSP可起超抗原的作用，把抗原直接提呈给γδΤ细胞，使其活化、增殖、发挥细胞毒功能［10，11］，是一种非特异性的免疫应答。而HTA?HSP70BCG对Hca?F细胞有较强的杀伤能力，对L929细胞有微弱的杀伤能力，其机制可能由于HSP70BCG结合了Hca?F细胞中的肿瘤抗原肽所引起的特异性免疫应答（这是主要方面），不排除由于该复合物中含有HSP引起一定程度的非特异性的免疫应答成分，HTA?HSP70BCG组对Hca?F细胞有较强的杀伤能力及对L929细胞有微弱的杀伤能力（明显低于HSP70BCG组）支持此推断。该机制不仅为HSP70BCG的非特异性抗瘤机制提供实验室依据，还为应用HSPs作为载体在体外构建具有MHC非限制性的HSP多肽疫苗，诱导机体特异性免疫打下理论基础。
【】
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