人LAPTM4B新基因多态性与淋巴瘤易感性的关系
作者：孙丽，张青云，刘晔，钱娜
【摘要】 目的 探讨人新基因溶酶体相关4次跨膜蛋白质B（lysosome?associated protein transmembrane 4 beta，LAPTM4B）多态性与淋巴瘤易感性的关系。方法 以病例?对照研究的方法，基于特异性引物的PCR对350例正常人和166例胃癌患者进行LAPTM4B基因分型，用χ2检验检测淋巴瘤组和对照组基因型频率和其他参数的分布。结果 淋巴瘤组中LAPTM4B基因的*2等位基因的频率为34.94%，较对照组（24.14%）显著增高（P<0.001）。基因型分布在淋巴瘤组与对照组间差异有统计学意义。*1/2和*2/2基因携带者患淋巴瘤的危险性分别是*1/1的1.475倍（95％CI：0.994?2.189）与3.532倍（95％CI：1.802?6.923）。*2等位基因携带者患淋巴瘤的危险性是*1等位基因的1.710倍（95％CI：1.287?2.271）。LAPTM4B基因型分布与患者年龄、性别、病理类型、临床分期、HBV感染、乳酸脱氢酶（LDH）、β2?微球蛋白（β2?MG）以及有无全身症状等参数无明显关系。结论 LAPTM4B基因多态性与淋巴瘤易感性相关，*2等位基因可能是淋巴瘤发生的危险因素。
【关键词】 淋巴瘤；病例对照研究；LAPTM4B；癌基因蛋白质类；多态现象（遗传学）；易感性
Relationship between Human Novel Gene LAPTM4B Polymorphism and Susceptibility of Lymphoma
Abstract：Objective To investigate the possible association between the allelic variation of LAPTM4B and the genetic susceptibility of lymphoma. Methods The genotype of LAPTM4B was analyzed in 350 unrelated healthy adult individuals and 166 patients with lymphoma by utilizing polymerase chain reaction based on special primers. The genotypical distribution of LAPTM4B was analyzed by χ2 test.Results The allelic frequencies of the *2 were 34.94% and 24.14% in the lymphoma group and the healthy control group respectively, which was significantly different between the two groups（P<0.001）. The risk of suffering from gastric cancer was increased 1.475 times in the individuals of the *1/2 genotype（95％CI：0.994?2.189）and 3.532 times in the individuals of the *2/2 genotype of LAPTM4B(95％CI：1.802?6.923） compared with the *1/2 genotype. No association between the genotypical distribution of LAPTM4B and the clinical information on patients of lymphoma such as age,gender, pathological type, differentiation classification of TNM, lactate dehydrogenase(LDH)，β2?MG and infection of HBV.Conclusion The allele *2 of LAPTM4B might be the risk factor of lymphoma, which could be associated with genetic susceptibility of lymphoma.
Key words：Lymphoma；Case?control study；LAPTM4B；Oncogene proteins；polymorphism(Genetics)；Susceptibility
0 引言
近年来，淋巴瘤发病率有所增长，在恶性肿瘤中居第11位 [1]。目前已有大量研究证实环境、免疫、病毒和遗传等多种因素均可导致淋巴瘤的发生。而淋巴瘤的家族聚集现象提示其发病率具有遗传易感性 [2]。人新基因溶酶体相关4次跨膜蛋白质B （lysosome?associated protein transmembrane 4 beta, LAPTM4B）是通过荧光差异显示技术筛选出的在成人正常肝中低表达而在绝大多数肝癌组织中表达高度上调的cDNA片段 [3?5]。研究发现LAPTM4B存在两种等位基因：LAPTM4B*1和LAPTM4B *2。二者的区别在于第一外显子5’UTR内一段19bp的序列。同时发现LAPTM4B*2型等位基因可能是肝癌的易感基因，并且其基因多态性与肿瘤的相关性有一定的肿瘤特异性，并非所有肿瘤的易感性都与LAPTM4B基因相关 [4]。迄今为止，尚未有LAPTM4B基因型与淋巴瘤易感性关系的报道。因此，本研究采用病例对照设计，运用等位基因特异性扩增检测LAPTM4B基因多态性，对LAPTM4B基因多态性与淋巴瘤易感性的关系进行了初步探讨。
1 资料与方法
1.1 研究对象
（1）病例组166例淋巴瘤血液标本取自于2005年3月～2005年12月在北京肿瘤住院的淋巴瘤病人（男88例，女78例），年龄16～89岁，平均年龄49岁淋巴瘤诊断均经病理组织学确诊。 按WHO《肿瘤组织学分型》（2000）标准进行分类，根据Ann Arbor分期标准进行分期。（2）正常对照组350例为北京大学临床肿瘤学院经体检及辅助检查排除各种恶性疾病的健康人员（男125例，女225例），年龄25～89岁，平均年龄54岁。对照组的性别、年龄与病例组都相匹配。对照组数据引自刘晔等的资料［6］。
1.2 方法
取静脉抗凝血2ml，酚?氯仿法抽提，无水乙醇沉淀得DNA，4℃ TE液中保存24h以上即可进行PCR反应。参照邵根泽的方法 [7]，在第一外显子19bp序列两侧设计一对引物，即上游引物序列为P1：5′?GCCGACTAGGGGACTGGCGGA?3′，位于72?92；下游引物序列为P2：5′?CGAGAGCTCCGAGCTTCTGCC?3′，位于 255?275，由上海申能博采公司合成。PCR反应体系如下：ddH2O17.0μl，10×Taq buffer 2.5μl，20mmol/L MgCl2 1.5μl，Taq酶2.5U，10mmol/L dNTP 0.5μl，上下游引物10μmol各1μl，β?actin上下游引物10μmol各0.25μl， cDNA模板1.0μl（70ng）。PCR条件如下：95℃预变性5min；94℃ 30sec, 62℃ 30sec, 72℃ 30min, 35个循环；72℃延伸10min。
扩增产物经2%琼脂糖凝胶（0.5μg/ml溴化乙锭）70V稳压电压分离PCR产物50min，以100bp Marker为标准分子量，在紫外灯下检视各条带并分析结果。取人β?actin作为阳性内对照，上游引物为5′?AACTGGGACGACATGGAGAA?3′，下游引物为5′?GGTAGTCAGTCAGGTCCC ?3′，由北京赛百盛公司合成。
1.3 统计方法
应用SPSS11.5软件包对实验数据进行统计分析。χ2检验用于淋巴瘤组和对照组基因型频率和其他参数的分布分析。用OR值和95% 可信区间（95%CI）评估研究因素对淋巴瘤的危险度大小。
2 结果
2.1 LAPTM4B基因型PCR检测结果
本实验分析比较了350例正常人和166例患者的基因型别频率，PCR扩增产物出现三种基因型，见图1。根据电泳条带，在LAPTM4B*1/1和*2/2纯合子个体中，PCR分别能扩增出一个204bp或223bp的DNA片段，而在杂合子*1/2中能同时扩增出这两个片段。β?actin阳性内对照扩增产物为318bp。本研究发现在淋巴瘤组中LAPTM4B基因的*2等位基因的频率为34.94%，而对照组为24.14%，较对照组显著增高（χ2＝13.846，P<0.001）。*2等位基因携带者患淋巴瘤的危险性是*1等位基因的1.710倍（95％CI：1.287?2.271）。本研究中LAPTM4B各基因型频率在正常对照组分别为：*1/1为56.86％，*1/2为38.00％，*2/2为5.14％，其基因型分布符合哈迪?温伯格平衡（P＝0.857），表明被测试人群具有代表性。在淋巴瘤组分别为：*1/1为44.58%，*1/2为40.96％，*2/2为14.46％。其分布频率在淋巴瘤组和对照组显著性差异（χ2＝15.303，P<0.001）。*1/2和*2/2基因携带者患淋巴瘤的危险性分别是*1/1的1.475倍（95％CI：0.994?2.189）与3.532倍（95％CI：1.802～6.923），见表1。表1 淋巴瘤组患者和对照组基因型及等位基因分布情况（略）
2.2 LAPTM4B基因型与淋巴瘤临床病理等参数之间的关系
本研究未发现淋巴瘤组患者年龄、性别、病理类型、临床分期、HBV感染、乳酸脱氢酶（LDH）、β2?微球蛋白（β2?MG）及有无全身症状等参数与LAPTM4B基因型之间有关系，见表2。表2 淋巴瘤组LAPTM4B基因型分布与临床病理等参数的关系（略）
3 讨论
人肝癌相关新基因LAPTM4B是与细胞增殖、分化相关的基因，其过表达可能导致细胞的增殖失控、迁移及侵袭增强。在肝癌中LAPTM4B的表达与肝癌的分化程度负相关 [8]，过表达时会导致细胞增殖加速，并且发生增殖失控及恶性转化，同时LAPTM4B在睾丸、卵巢等生殖腺组织上调表达这一现象与许多癌基因相似，这些结果提示LAPTM4B可能是一个与细胞增殖调控相关的原癌基因，对于肿瘤的发生、起重要作用 [7]。
邵根泽等 [7]研究表明，肝癌人群*2/2基因型频率显著高于正常对照组，*2/2型比其他基因型个体患肝癌风险高（OR＝2.888）。此外，邓丽娟等 [2]的研究结果也证明肺癌人群*2/2基因型别频率显著高于正常对照组，OR值为3.26。这提示LAPTM4B与肝癌及肺癌遗传易感性相关。我们对166例淋巴瘤患者和350名健康对照者的研究显示，淋巴瘤组中*2等位基因的频率为34.94%，较对照组24.14%显著增高（P<0.001）。携带*2等位基因可使个体患淋巴瘤的危险性增加1.710倍（95％CI：1.287～2.271）。淋巴瘤组带有*2等位基因的基因型亦显著高于对照组，*1/2和*2/2基因携带者患淋巴瘤的危险性分别是*1/1的1.475倍（95％CI：0.994～2.189）与3.532倍（95％CI：1.802～6.923）。这些结果均提示*2等位基因也与淋巴瘤易感性相关。
LAPTM4B两个等位基因*1和*2除在第一外显子非编码区19bp序列不同，其他序列均相同。因此，不同等位基因对肿瘤不同的易感性只能归结于这19bp的基因序列。首先，这19bp的不同可能导致LAPTM4B两个等位基因所编码的蛋白质结构及活性功能的不同。如图2所示，等位基因*1的读码框预期编码一个317个氨基酸残基的蛋白；而等位基因*2由于19bp序列的插入，其对应于*1等位基因5′UTR中的终止密码因错位而被消除，导致蛋白质编码框在N端相上游延长了53个氨基酸，因此它编码一个370 个氨基酸残基的蛋白 [4]。LAPTM4B 蛋白N端蛋白序列是分子的重要功能域，它可能与多种信号分子（如Src家族、Sos、Grb?2、PLC?γ、PI?3K、及STAT41等）结合，在调节细胞增殖信号的转导中起重要作用 [9]。所以N端的改变可能使蛋白的结构域和（或）功能域发生变化。此外，这19bp的不同可能作为一个顺式作用元件，与一些转录因子或核蛋白结合，在LAPTM4B的基因转录中起到不同的调控作用，导致其表达部位和水平不同。
第一外显子的部分序列。核苷酸编号以预测的转录起始位点为+1。终止密码子以＃号标记。两个等位基因的19bp序列以下划线标示。等位基因*1的mRNA仅可以从nt157开始翻译，因为在nt40和nt103处有终止密码子。等位基因*2由于19bp序列的插入，终止密码子因错位而被消除， mRNA可以从nt17开始翻译，导致蛋白质编码框在N端向上游延长了53个氨基酸（以带点字母表示）。
核苷转运蛋白LAPTM4α是一个进化上非常保守的与抗耐药有关的溶酶体4次跨膜蛋白，LAPTM4B与核苷酸转运蛋白LAPTM4α具有46％的同源性 [10?12]，并且其C端也有典型的溶酶体靶向定位信号，所以它有可能作为一转运蛋白存在于内吞体和或溶酶体等细胞器内膜系统 [9]。因此，可能在外源性物质在体内的转运，代谢中起作用。那么其不同LAPTM4B蛋白结构或者活性的不同可导致其转运功能或活性的差异，从而对致癌物的代谢，抗癌物的清除或其他生理过程的不同，导致个体对肿瘤的易感性不同。
此外，本研究未发现淋巴瘤组患者年龄、性别、病理类型、临床分期、HBV感染、乳酸脱氢酶（LDH）、β2?微球蛋白（β2?MG）及有无全身症状等参数与LAPTM4B基因型之间具有相关性。提示LAPTM4B基因型在不同病理类型的淋巴瘤中的作用可能相似。而LAPTM4B基因型在肝癌及肺癌中也未发现其与病理类型等参数有相关性，这提示LAPTM4B不同的等位基因可能通过相似的途径对不同肿瘤的易感性起作用。
综上所述，本研究证实了LAPTM4B*2等位基因与淋巴瘤易感性相关，等位基因*2比*1可能更容易遭受病毒、免疫和环境等因素的攻击而导致基因的失控表达，从而在肿瘤的启动中发挥作用或者推动肿瘤的演进；相对而言，等位基因*1 更具保护性。因而，LAPTM4B*2等位基因可能作为筛查淋巴瘤易感人群和高危人群的指标，具有应用价值。
【】
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