以端粒酶为靶治疗肺癌研究进展
【摘要】 端粒酶是一种可以维持端粒长度的RNA酶，抑制端粒酶可能会使端粒缩短并使肿瘤无限增殖停止。该文就端粒酶在肺癌中的研究进展作一综述。
【关键词】 端粒末端转移酶 肺肿瘤 基因疗法 病毒 免疫疗法
Progress on Telomerase as Targetting Therapy for Lung Cancer
Abstract:Telomerase is a kind of RNase that can maintain the length of telomere. Inhibition of telomerase may lead to telomere shortening and cessation of unrestrained tumor proliferation. Research progress of telomerase for lung cancer therapy was summarized in this article.
Key words: telomerase;lung neoplasms;gene therapy;viruses;immunotherapy
1 端粒酶的结构和功能
端粒酶于1984年首次被发现，它是一种逆转录酶，位于细胞核内。端粒酶有两个主要组成部分及相关蛋白组成，一个主要组成部分为端粒酶RNA（human telomerase RNA,hTR）,hTR是合成端粒DNA的模板，人体内所有细胞中都含有hTR。另一主要组成部分是端粒酶催化亚基 (human telomerase reverse transcriptase,hTERT)，hTERT是决定端粒酶活性的限速因子，与端粒酶活性呈正相关，正常体细胞中不含hTERT，造血细胞、生殖细胞及肿瘤细胞中含有hTERT[1，2]。
正常人体细胞的端粒长度约5~15kb，端粒长度随着年龄的增长和分裂次数的增多而逐渐缩短，一般DNA每复制1次，端粒丢失50~200bp，当它缩短到一定程度时，细胞则停止分裂而衰老、死亡。在极少数情况下，个别细胞的端粒酶激活，以自身的RNA为模板合成端粒DNA，修复被损伤的端粒DNA，稳定其长度，使细胞走向永生化，而永生化又被认为是细胞恶化的必要步骤。肿瘤细胞的端粒长度很短，其继续缩短将导致染色体融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的长度，从而维持肿瘤的继续分裂、增殖和生存［3］。端粒酶的激活，可能是肿瘤形成和的共同途径。
2 端粒酶表达和肺癌
Taga S等[4]在观察NSCLC中端粒酶活性及其对预后影响的一项研究中，以端粒重复序列扩增法（TRAP法）测定端粒酶活性，103例NSCLC病人术后癌组织标本中有85例端粒酶呈阳性（82.5％），另18例为阴性（17.5％），而邻近正常组织中端粒酶均为阴性。Hiyama等[5]用TRAP法测定了136例原发性肺癌的手术切除标本癌组织端粒酶活性, 其阳性率为80.1% (109/136) , 而邻近正常组织标本的端粒酶活性阳性率仅4.4% (3/68)，其中SCLC标本的端粒酶活性阳性率为100％(强阳性)。因为端粒酶主要存在于恶性肿瘤，而在大多数正常组织中没有活性或活性很低，同时由于端粒酶在恶性肿瘤的发生，尤其是在肿瘤的发展中起着关键的作用［3］，所以，通过各种途径抑制端粒酶的活性，可能将有效地抑制肿瘤的生长，而对大多数正常细胞没有影响。端粒酶与恶性肿瘤之间令人惊异的相关性，使它在肿瘤的治疗上有望成为行之有效的新的靶目标。
3 端粒酶在肺癌治疗中的应用进展
目前肺癌治疗因子中以端粒酶为靶的包括：以端粒酶为靶向的反义基因、自杀基因，以表达端粒酶细胞为靶的溶瘤病毒，端粒酶特异性的免疫治疗，小分子端粒酶抑制剂等,其中以端粒酶为靶向的基因治疗研究进展较快。
3.1 以端粒酶为靶向的基因治疗
3.1.1反义基因治疗
①端粒酶RNA（hTR）的反义基因治疗
Feng等[2]用反义hTR抑制恶性肿瘤，并可因此导致肿瘤细胞的死亡。何剑等[6]用脂质体介导的端粒酶hTR反义寡核苷酸转染A549肺腺癌细胞株， 采用TRAPPCRELISA法半定量检测转染后肺腺癌细胞端粒酶活性,在端粒酶反义寡核苷酸转染549细胞72h后，A549细胞端粒酶活性明显下调。这表明端粒酶反义寡核苷酸可以有效抑制肺腺癌细胞端粒酶活性。Song JS等[7]以一种表达反义端粒酶模板RNA序列的腺病毒抑制hTR的开放部分，发现反义端粒酶腺病毒可以抑制端粒酶活性，并抑制肿瘤细胞的生长及生存。进一步地用FACS和TUNEL分析表明，肿瘤细胞减少的生存能力是由诱导凋亡介导的。这表明，用端粒酶RNA反义寡核苷酸诱导肺癌细胞凋亡有可能是在靶向性肿瘤基因治疗中的一种有效的抑制肿瘤生长的方法。
②端粒酶催化亚单位（hTERT）的反义基因治疗
由于hTR在多种正常体细胞中有表达，以此为靶缺乏肿瘤特异性。而hTERT在肿瘤组织中高表达，正常体细胞中则检测不到，因此具有更高的肿瘤特异性，是更加理想的肿瘤端粒酶抑制靶点[2]。
田凤军等[8]采用逆转录病毒介导的反义hTERT 作用于肺癌细胞A549，结果显示反义hTERT作用肺癌细胞后hTERT蛋白表达下降、端粒酶活性抑制；细胞倍增20周期后出现生长抑制，并出现明显的细胞凋亡。提示反义hTERT能够抑制肺癌细胞A549的端粒酶活性，抑制肿瘤细胞生长，促进细胞凋亡；针对hTERT 来治疗肿瘤有可能成为一种新的肺癌基因治疗方法。
3.1.2自杀基因疗法
由于hTERT仅在诸如肿瘤及胚胎细胞等具有端粒酶活性的细胞和组织中表达，也即在这些组织中存在hTERT基因启动子的活性，因此可以将由hTERT基因启动子调控的自杀基因整合到腺病毒载体中，以特异性地作用于肿瘤细胞。
Song JS等在2004年报道了利用hTERT基因启动子靶向治疗肿瘤的可能性。他们克隆出由hTERT基因启动子调控的来自单纯疱疹病毒的自杀基因（HSVTK），与腺病毒载体构成AdhTTK的重组体，并使它们分别感染到正常的细胞系和小细胞肺癌的细胞系中去。通过实验，证实了由AdhTTK介导的选择性、特异性的肿瘤细胞死亡。进一步用ELISA和FACS分析方法检测细胞死亡，发现肿瘤细胞生存能力减少是由凋亡诱导作用介导的，它表明这种方法有可能是肿瘤靶向基因治疗方法中的一种抑制癌细胞生长的有效方法[9]。但这种方法有可能会在杀伤肿瘤细胞的同时损伤生殖细胞、造血细胞等具有端粒酶活性的正常细胞。
由于60％～80％的SCLC细胞是端粒酶阳性且myc过度表达的，而正常人类细胞则无。Song JS又于2005年初报道了利用MycMax反应元件（MMRE）和SV40增强hTERT基因启动子的活性，以更好地调控自杀基因。通过MMRE、hTERT 基因启动子及SV40 增强子调控自杀基因HSVTK的活性，构造该HSVTK的腺病毒载体（AdMMREhTTKenh）并感染SCLC细胞，可以诱导端粒酶阳性且myc过度表达的肿瘤特异性细胞死亡。被AdMMREhTTKenh感染的SCLC细胞受抑制程度和受诱导凋亡的程度显著地大于被AdhTTK感染的SCLC细胞，且更加具有肿瘤特异性[10]。因此利用hTERT基因启动子调控自杀基因的疗法可以用于特异性的SCLC的靶向基因治疗。
3.2 肿瘤特异性的溶瘤病毒
为诱导病毒介导的肿瘤细胞溶解而设计的载体， 可以选择性地在肿瘤中进行病毒繁殖。端粒酶激活被认为是致癌过程中关键性的一步，其活性与hTERT密切相关。Kawashima T等在人类肿瘤细胞上研究具有复制能力的hTERT特异性的腺病毒（telomerasespecific replicationcompetent adenovirus，TRAD）的抗癌作用。在体内和体外试验中检查TRAD在人类肿瘤细胞中具有选择性复制和抗肿瘤作用，但在正常细胞诸如成纤维细胞中则无。TRAD在一系列人类肿瘤细胞系上都能有效地复制并诱导显著的杀细胞效应，其复制和毒性在缺少端粒酶活性的人类成纤维细胞中则明显减弱。在移植了人SCLC组织的裸鼠上，瘤内注射TRAD可导致明显的肿瘤生长抑制，尽管在循环中存在TRAD，TRAD在瘤外组织中不能检测到。此外，在未注射TRAD的远处肿瘤中也有TRAD的复制[11]。hTERT启动子赋予TRAD在人类肿瘤中选择性复制并进而使肿瘤细胞溶解的能力，其对于肿瘤治疗有重要的应用价值。
3.3 调节端粒酶表达的免疫
越来越多的证据表明，来自hTERT的多肽可以被细胞毒性的T淋巴细胞（CD8＋的T淋巴细胞）特异性地识别。通过用来自hTERT的肽461469(hTERT461)反复刺激健康供体，Tajima K等研究了一种人类白细胞抗原(HLA)A24限制性的CD8+的T细胞克隆（K31），它能介导特异性的溶细胞作用。用K31处理从肺癌病人胸腔积液中获得的原发性肺腺癌细胞，可以观察到肿瘤细胞溶解。在使用IFNγ处理后，肿瘤细胞端粒酶表达减少，K31介导的溶细胞作用相应减弱。该研究表明干扰素γ可特异性地调节肺癌细胞对端粒酶特异性的细胞毒性T淋巴细胞的易感性。强调hTERT461肽在肺癌免疫治疗中的作用，并表明在治疗上应该考虑使用IFNγ调节端粒酶的表达[12]。
3.4 其 他
BIBR1532是一种非核苷小分子，它能选择性抑制端粒酶活性。用BIBR1532处理NCIH460肺癌细胞，对肿瘤细胞的短期生存和增殖没有影响，但在经过100次细胞分裂后，肿瘤细胞的生长速度减慢，140次细胞分裂后，肿瘤细胞停止增殖，且其端粒长度比对照组平均短1.5～4kb[13]。
目前的使用促凋亡基因的肿瘤基因治疗之所以进展有限，是因为这些方法缺少组织及肿瘤特异性而易于导致副反应。为了以肿瘤细胞为靶向而不损伤正常细胞，一种新的针对肺癌的双重强化系统（在hTERT催化因子与人类表面活性蛋白A1催化因子控制下的TTF1基因）近期被研究出来，其中肿瘤特异性催化因子控制下的组织特异性转录系统可以促进肿瘤治疗基因表达。通过将其应用到肺癌治疗中显示了这种系统的有用性。这种肺癌系统被称为TTS。 TTS系统在肺癌细胞中的催化活性比在其他癌细胞、正常肺组织，包括干细胞中的活性都高很多。此外，将负性糖皮质激素反应元件插入TTS中，它还可以被药物调控[14]。
以端粒酶为靶向的药物可能是一类特异性强，毒性小的较理想的新一代治疗肺癌的药物。但这类药物大多数的抗增殖作用有赖于特定肿瘤细胞的端粒酶长度，临床效果要到染色体末端的端粒完全丢失才能显示出来。因此抗端粒酶治疗最有可能的应用是作为其他减瘤细胞治疗如手术、化疗、放疗等的一种辅助治疗手段。另外一种可能应用是作为疾病完全缓解后的治疗以消除微小的残存病灶，减少肿瘤复发转移的可能。
但从目前的研究来看，这种药物可能也存在一些问题： (1)人体内有一些正常细胞也有端粒酶的活性，如生殖细胞、骨髓细胞等增殖活跃的细胞，以端粒酶为靶向的抗肿瘤药物对这些细胞可能会有一定的毒性作用。(2)端粒酶抑制剂类型的抗肿瘤药物的应用同其它的抗癌药物一样，也会产生耐药性问题[15]。因为端粒酶抑制剂的应用，抑制了肿瘤细胞中的端粒酶活性，非端粒酶依赖性端粒调控机制有可能会代偿性激活，从而使端粒酶抑制剂对此肿瘤无效。(3)有些肿瘤细胞检测不出端粒酶活性，有些虽有端粒酶活性，但同时也可能存在非端粒酶依赖性端粒调控机制[16]。在这种情况下，以端粒酶为靶向的抗肿瘤药物可能会无效。
但无论如何，端粒酶仍然是真核细胞永生化最广泛最经典的途径之一。因此, 针对端粒酶的抗肿瘤治疗仍可能是有希望的恶性肿瘤治疗方案之一。相信随着对端粒酶研究的进一步深入，有望能开发更有效的控制与治疗肺癌的药物。
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