大鼠全脑照射后脑内一氧化氮含量的变化

【摘要】  　　［目的］观察大鼠全脑照射后脑组织中一氧化氮（NO）含量的变化，探讨放射性脑损伤中NO所起的作用。［方法］ 对SD大鼠用4MeV线单次全脑5Gy、15Gy和30Gy照射后，于照射后6h、1d、2d和3d检测大鼠大脑皮层中NO的含量。［结果］5Gy、15Gy和30Gy照射后1d、2d，脑内NO随照射剂量递增而增加（P<0.05），而在6h和3d各剂量组无差异。各剂量组在1d时脑内NO达峰值，2d时逐渐下降，3d时恢复对照组水平。［结论］ 大鼠全脑照射后脑组织中NO升高，它在放射性脑损伤的发病机制中可能有重要的作用。

【关键词】  脑　辐射电离　一氧化氮　大鼠　辐射损伤　脑损伤

　　 Changes on Concentration of Nitric Oxide in Brain Following Wholebrain Irradiation in Rats

    ［Purpose］To study the change of nitric oxide （NO） in the brain following wholebrain irradiation in rats and the effect of NO in brain radiation injury.［Methods］The whole brain of SD rats was irradiated by the single dose of 5，15 or 30Gy with 4 MeV electron beam. The concentrations of NO in the brain cortex tissue supernatant were measured at the 6 hour, day 1, day 2 andday 3 postirradiation.［Results］The levels of NO in the brain 1 day and 2 days postirradiation increased with radiation dose, but there was no significant difference between 5，15 or 30Gy group at 6 hours and the 3rd day respectively.Cortical NO peaked at day 1 after irradiation, then reduced gradually at day 2 and returned to the level of control group at day 3 after irradiation. ［Conclusions］Concentration of NO increases in brain following wholebrain irradiation,which might play an important role in the pathogenesis of brain radiation injury.

    Key words: brain;irradiation,ionizing; nitric oxide; rats;radiation injuries;brain injuries

    近年的研究表明：神经系统在各种损伤情况下，一氧化氮（Nitric oxide, NO）的合成增加[1，2]。本实验对大鼠大脑电离辐射后，运用生化法检测脑组织中NO的含量，探讨NO在放射性脑损伤过程中的时相变化及其意义。

    1 材料与方法

    1.1 动物及分组

    将健康成年的雌性SD大鼠（苏州大学实验动物科提供），随机分为正常对照、麻醉对照、5 Gy 、15 Gy和30 Gy分别单次全脑照射后6 h、1d、2d和3d等14组。实验中用3.6%水合氯醛（1ml/100g体重）对大鼠进行腹腔麻醉，用Philips SL18型加速器产生的能量为4MeV的电子线照射，详细的投照与剂量确认方法见前文报告[3]。

    1.2 实验方法

    各组大鼠麻醉后，用含肝素的生理盐水（250ml左右）经主动脉作全身灌注，完整取脑。取大脑皮层100mg左右，按20：1加入0.1mol PBS液后充分研磨10min，将匀浆置于Eppendorf管内，在4℃恒温、15000r/min的条件下离心20min（德国Biofuge22 离心机），取上清液于-70℃保存。

    1.3 测定指标

    将上述方法收集的大鼠大脑皮层上清液每组取6份进行测量，依照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒的说明进行操作。

    1.4 统计学处理方法

    14个组的脑组织中一氧化氮的含量，以均数±标准差(x±s)表示。采用方差分析，先分析同一时间点不同剂量之间的差别；然后再分析同一剂量下不同时间点之间的差别。

    2 结 果

    6h 与3d 时各剂量组之间大鼠脑组织中NO含量无差异。1d 时5Gy 、15Gy和30Gy组大鼠脑皮质NO含量较对照组明显升高（P<0.01），随着剂量递增脑内NO含量增加，其中15Gy和30Gy组同5Gy组比较有明显差异（P<0.01），15Gy和30Gy组之间比较P<0.05。2d时15Gy和30Gy组较对照组明显升高（P<0.01），15Gy和30Gy组较5Gy组P<0.01，而15Gy和30Gy组之间比较没有差异（P>0.05）。而在5Gy照射后脑内NO含量1d时达到高峰，同其它时间点比较差异显著（P<0.01）。15Gy及30Gy 照射后表现为同样的结果，1d时为峰值，同其它时间点比较差异显著（P<0.01），2d时逐渐下降，同1d及3d比较有显著性差异，与6h组比较也有差异（P<0.05）。为了了解实验中水合氯醛腹腔麻醉对NO含量的影响，设计了麻醉但未照射的对照组，大鼠脑组织上清液中NO的含量麻醉对照组为（0.87±0.08）μmol/g，与正常对照组（0.86±0.06）μmol/g比较差异无显著性。

    3 讨 论

    目前已知NOS亚型有3大类，即神经元型（nNOS）、内皮细胞型（eNOS）和诱导型（iNOS），nNOS和eNOS在正常生理条件下即有表达，而iNOS的合成需外界刺激的作用，iNOS一旦生成即连续催化产生NO，而过量的NO则引发组织的某些病理生理过程的发生 [4]。

    亚致死剂量γ射线照射小鼠后，体内一些器官（肝、肠、肺、肾、脑、脾和心脏）NO产生增加。Lestaevel等[5]报道给予大鼠15Gy全身照射，脑内的NO于照射后即刻升高，1 d达到高峰。用iNOS抑制剂（AMT）处理后，NO下降到平均基础水平，说明NO升高可能通过iNOS介导。Clarencon等[6]通过腹主动脉探测NO电信号实验发现，γ射线15Gy照后12min增高13%，照后130min缓慢增高18%；另外，经胸腔穿刺取血检测NO电信号，15Gy照后90min增高17%，照后24 h增高25.6%，照后3d明显降低。

    本研究应用硝酸还原酶法检测大脑皮层组织上清液中NO的变化，在排除了实验中麻醉对含量的影响后，我们观测到在1d、2d 两个时间点，NO水平表现出剂量依赖性升高。而在5、15和30Gy照射后1d时脑内NO达高峰，2d逐渐下降，3d恢复照射前水平。

    由此看来，在大鼠大脑受到较大剂量照射后，NO在脑内含量升高。结合大鼠在照射后，脑内血液循环和兴奋性氨基酸、炎性细胞因子等变化特点[3]，推测由于脑内兴奋性氨基酸的释放，通过激活N甲基D天门冬氨酸（NMDA）受体，使细胞内钙增加，激活结构型NOS活性，使NO生成增加[7]；另外，脑组织分泌白细胞介素1和肿瘤坏死因子增加，又可激活iNOS，使其表达增加，生成过量的NO[8]。

    本实验研究表明，在大鼠放射性脑损伤后，脑组织内NO水平升高。过量的NO可通过多种途径对脑组织造成损害，引起迟发的不可逆的神经元损伤。

【】
  [1] Keynes RG, Garthwaite J. Nitric oxide and its role in ischaemic brain injury[J]. Curr Mol Med, 2004, 4:179-191.

[2] Broholm H, Andersen B, Wanscher B, et al. Nitric oxide synthase expression and enzymatic activity in multiple sclerosis[J]. Acta Neurol Scand, 2004, 109:261-269.

[3] 田野，包仕尧，殷蔚伯. 大鼠半脑照射后早期脑内血流量和含水量变化的研究[J].中华放射肿瘤学杂志， 1999，8：43-46.

[4]Amer FS, Ted MD, Vahna LD. Nitric oxide synthase in models of focal ischemia[J]. Stroke, 1997,28:1283-1288.

[5]Lestaevel P, Clarencon D, Gharib A, et al. Nitric oxide voltammetric measurements in the rat brain after gamma irradiation [J]. Radiat Res, 2003,160:631-636.

[6]Clarencon D, Lestaevel P, Laval JD, et al. Valtametric measurement of blood nitric oxide in irradiated rats[J]. Int J Radiat Biol, 1999,75:201-208.

[7]Leach JK, Black SM, SchmidtUllrich RK, et al. Activation of constitutive nitricoxide synthase activity is an early signaling event induced by ionizing radiation[J]. J Biol Chem, 2002,277:15400-15406.

[8]Blais V, Rivest S. Effects of TNFalpha and IFNgamma on nitric oxideinduced neurotoxicity in the mouse brain[J]. J Immunol,2004,172: 7043-7052.