CHK1和CHK2在食管癌组织中的表达
【摘要】 目的 观察CHK1和CHK2在食管癌和癌旁不典型增生组织中的表达及其与食管癌单纯放疗疗效的关系。方法 采用Western Blotting方法检测33例胃镜活检标本诊断为食管鳞癌以及12例癌旁不典型增生组织中CHK1和CHK2蛋白表达，分析单纯放疗的疗效及预后相关因素。结果 33例食管癌组织和12例癌旁不典型增生组织中CHK1和CHK2蛋白表达量均无明显差别(P＞0.05)。33例食管癌病人单纯放疗后1年生存率为61.44%，中位生存期11.5个月；单因素分析显示年龄、食管造影X线病变长度、CT扫描显示病变长度、临床T分期、N分期、近期疗效以及临床分期均与食管癌放疗预后有关（P＜0.05）；COX多因素分析仅临床分期为独立预后因素；而食管癌组织中CHK1和CHK2表达对预后无明显影响（P＞0.05）。结论 CHK1和CHK2不能作为判断食管癌放疗预后的指标，而临床分期则是影响食管癌单纯放疗疗效的主要因素。
【关键词】 食管癌 细胞周期检测点激酶 放疗 预后
0 引言
细胞周期检测点激酶1和2（CHK1和CHK2）是生物进化过程中非常保守的蛋白激酶，在DNA损伤引起的细胞周期检测点调节中有着非常重要的作用。CHK1和CHK2在多种人正常和肿瘤组织中均有表达，并可能与某些肿瘤的发生有关[1]。食管癌组织中CHK1和CHK2表达情况如何，尚未见报道。为此应用Western Blotting方法检测食管癌组织及癌旁组织中CHK1和CHK2蛋白表达，分析其对单纯放疗疗效的影响，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 病例入组条件
①收集2003年11月～2004年7月在河北医科大学第四放疗科诊治的食管癌初诊患者33例；② 内窥镜下在病灶及不碘染区多点取材，病灶及不碘染区处分别诊断为鳞癌和不典型增生者入组；③放疗前行胸部CT扫描和食管钡餐造影X片以及腹部超声波检查，疗前及疗中常规行血液学检查；④疗前KPS评分均≥70分，无严重心脑血管疾病和放疗禁忌症；⑤ 所有患者均接受单纯根治性放疗，疗前、疗中和疗后未行辅助性。
1.2 一般资料
33例食管癌中，男22例、女11例，男∶女为2∶1；中位年龄60岁（37～82岁）。病变部位：颈段2例、胸上段8例、胸中段18例、胸下段5例。食管造影X线片显示病变长度：≤3.0cm者5例、3.1～5.0cm者9例、5.1～8.0cm者12例、＞8cm者7例；X线病理分型：髓质型29例、溃疡型和缩窄型各2例。CT扫描显示病变长度：≤3.0cm者4例、3.1～5cm者8例、5.1～8cm者12例、＞8cm者9例。按照祝淑钗[2]提出的非手术治疗食管癌分期标准，T分期：T1 3例、T2a 12例、T2b 13例、T3a 2例、T3b 2例、T4 1例；N分期：N0 13例、N1 9例、N2 11例；M分期：M0 31例、M1 2例；临床分期：Ⅰ期2例、Ⅱa期7例、Ⅱb期7例、Ⅲa期7例、Ⅲb期5例、Ⅵ期5例。
1.3 放疗
常规放疗组于模拟机下定位，以食管病变中心为射野中心，给予一前野加两后斜野避开脊髓照射。适形放疗组先行热塑体模固定体位，标记三维激光灯点以保证治疗重复性。以CT扫描模拟定位，层厚3cm，应用三维适形放射治疗计划系统（CMS公司）进行扫描图像的数字化传输、三维重建，勾画肉眼可见的病灶靶区（包括原发肿瘤和转移淋巴结GTV），一般上下两端外扩3.0cm，前后左右外扩1.5cm作为临床靶区（CTV），通常给予3个共面或非共面照射野，靶区周围重要脏器剂量分布，确认治疗计划给予肿瘤最高致死剂量的同时确保周围正常组织受照不超过耐受剂量。常规分割照射2Gy/d，5次/周，肿瘤总剂量50～70Gy，中位剂量60Gy。
1.4 食管癌组织中CHK1和CHK2蛋白表达的检测
收集33例食管癌标本和12例癌旁不碘染标本分别提取组织蛋白(组织蛋白裂解液由河北医科大学法医教研室提供)，考马斯亮蓝法（南京建成生物工程研究所）蛋白定量后，12%SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法电转印至PVDF膜上，依次经5%脱脂奶粉封闭、一抗CHK1和CHK2（美国Santa Cruz公司，按1∶300稀释）4℃过夜、辣根过氧化物酶（HPR）标记IgG（1∶2 000稀释）37℃孵育1h，DAB（北京中杉生物技术公司）显色。扫描后用凝胶分析软件分析，以光密度值代表蛋白的相对表达量。
1.5 统计学处理
采用SPSS11.5统计分析软件对结果进行统计分析。计量资料采用t检验，生存分析采用Kaplan?Meier方法，单因素分析采用Log?rank检验，多因素分析采用COX比例风险回归模型。
2 结果
2.1 食管癌组织中CHK1和CHK2蛋白表达
Western Blotting检测发现, 33例食管癌组织和12例癌旁不典型增生组织中，CHK1和CHK2蛋白均有表达见图1、2；用凝胶成像仪进行蛋白半定量分析，33例食管癌组织与12例癌旁不典型增生组织中的CHK1和CHK2蛋白表达量无明显差异（P＞0.05），见表1。
图1 Western Blotting检测食管癌组织中CHK1和CHK2蛋白表达（略）
图2 Western Blotting检测食管癌旁不典型增生组织中CHK1和CHK2蛋白表达（略）
表1 Western Blotting半定量法分析食管癌及癌旁不典型增生组织中CHK1和CHK2蛋白表达（略）
2.2 食管癌组织中CHK1和CHK2蛋白表达与单纯放疗疗效的关系
2.2.1 食管癌单纯放疗后生存率
33例食管癌患者随访至2005年3月1日，随访率100%，生存期从放疗开始日期计算，中位随访期9个月（范围3～15个月）。33例单纯放疗后1年生存率61.44%，中位生存时间11.5个月（范围3～15个月）。放疗后CR21例、PR12例，总有效率（CR+RP）为100%。
2.2.2 食管癌预后相关因素分析
单因素分析显示年龄、食管造影X线长度、CT扫描显示病变长度、临床T分期、N分期、临床分期以及近期疗效均与食管癌单纯放疗预后有关（P＜0.05）；COX多因素分析仅TNM临床分期为独立预后因素，见图3、表2。而患者性别、病变部位、放疗方法（常规/适形）、放疗总剂量、以及肿瘤组织中CHK1和CHK2表达量等均与预后无明显关系（P＞0.05）。
图3 食管癌单纯放疗后不同临床分期的生存曲线（略）
表2 食管癌单纯放疗后预后相关单因素及多因素分析（略）
2.2.3 食管癌不同预后因素间的相关性
对影响食管癌预后因素进行相关性检验，发现肿瘤X线造影长度、CT长度和胃镜长度之间以及与它们与T和临床分期之间有正相关性，P值均＜0.05，见表3；而CHK1和CHK2蛋白表达与肿瘤X线造影、CT和胃镜所显示病变长度、肿瘤临床T分期、N分期、临床分期以及近期疗效之间均无相关性，P值均＞0.05。
表3 影像学检查与临床分期的相关性分析 （略）
3 讨论
CHK1和CHK2是非常重要的细胞周期检测点调节蛋白，在人类多种肿瘤组织中均有表达[1]。本研究结果显示33例食管癌组织和12例癌旁不典型增生组织中CHK1和CHK2蛋白均有表达。CHK1和CHK2作为效应激酶，其蛋白的稳定表达有利于维护DNA损伤修复和细胞周期检测点调节，以保证细胞基因组的完整和稳定[1]。
CHK1和CHK2与肿瘤的发生是否有关系，以往研究报道结果不完全一致。Tort等[3]报道，淋巴瘤组织中CHK1表达与肿瘤增殖活性没有明显的关系；Tort等[4]还报道，在所有类型淋巴瘤和反应性增生组织中CHK2mRNA和蛋白表达水平相似，而且CHK2表达与淋巴瘤的增殖活性无关，提示淋巴瘤的发生发展与CHK1和CHK2关系不大。但Shigeishi等[5]报道提示CHK1和CHK2在p53突变胃癌的细胞周期检测点功能中发挥重要作用。Bartkova等[6]报道CHK2在原位癌和非侵袭性精原干细胞肿瘤中表达较高，而在侵袭性精原干细胞肿瘤和奇胎瘤中弱表达或无表达。
食管癌是我国常见肿瘤，食管上皮不典型增生被认为是重要的癌前病变。本研究发现，食管癌组织与癌旁不典型增生组织中CHK1和CHK2蛋白表达均无明显差异，提示CHK1和CHK2可能与食管癌发生发展无明显关系，但由于病例数较少，还需进一步研究证实。本研究分析了33例食管癌单纯放疗后疗效及预后相关因素，结果发现仅临床分期为最主要的预后因素，临床分期越早，放疗预后越好；患者年龄、食管造影X线病变长度、CT扫描显示病变长度、临床T分期、N分期和近期疗效与预后也有关系，这与报道结果基本一致[7]。
本研究发现食管癌组织中CHK1和CHK2蛋白表达量高低与食管癌单纯放疗预后无关，提示CHK1和CHK2不能作为判断食管癌放疗疗效的预后指标。CHK1和CHK2蛋白表达高低还与食管造影X线和CT检查所显示的病变长度、T分期、N分期、临床分期以及近期疗效等均无明显相关性，提示CHK1和CHK2表达尚不能成为判断食管癌预后的指标。本研究结果还显示，X线食管造影和CT检查显示病变长度的一致性很高，而且二者均与T分期和临床分期正相关，病变长度越长，T分期和临床分期越晚；另外，CT显示病变长度与浸润深度也成正相关，病变越长浸润深度越深，这与文献报道结果一致[8]。另外，在33例食管癌组织中CHK1和CHK2蛋白均有表达；而Bartkova等[9]采用免疫组化分析发现，进展期（T2～T4）膀胱癌CHK2表达降低者为10.3%（6/58例），这可能与免疫组化法检测灵敏度较低有关。
本研究显示，食管癌和癌旁组织中CHK1和CHK2蛋白均有表达，虽然CHK1和CHK2表达可能与食管癌发生、发展和放疗疗效无明显关系，但其主要DNA损伤发生后，通过调节细胞周期检测点而影响DNA损伤修复，影响放疗和化疗药物的敏感性；因此有必要对食管癌细胞中CHK1和CHK2 激酶对照射后细胞周期的调控作用行进一步的研究。
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