乳腺癌BA46基因转染树突状细胞诱导特异细胞免疫
【摘要】 目的 探讨以腺相关病毒为载体，乳腺癌抗原BA46基因转染树突状细胞（DCs）诱导特异细胞免疫的可行性。方法 取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞（DCs前体细胞），以AIM?V培养基于6孔板培养，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞，取贴壁细胞，将细胞分为基因转染组及对照组，基因转染组感染携带BA46基因的重组腺相关病毒rAAV/BA46/Neo，对照组以293细胞裂解物冲击，两组细胞均采用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM?CSF）、白细胞介素4（IL?4）、肿瘤坏死因子?α(TNF?α)诱导DC前体细胞成熟。第7天，收集细胞(DCs)，显微镜观察细胞形态，流式细胞仪分析DCs的表面标志CD80、CD86、CD40、CD83、HLA?DR的表达情况；另取该DC与T细胞按比例混合，含5%人血清蛋白的AIM?V为培养基，同时加入IL?2与GM?CSF，共育7天，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，用3H?TdR掺入法检测转染BA46制备的DC刺激自体淋巴细胞增殖能力；取BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞，采用51Cr释放法测量杀伤效率，同时以流式细胞仪分析CTL 细胞中IFN?α和 IL?4的表达情况。结果 BA46基因转染制备的DCs形态正常，表面标志CD80、CD86、CD40、CD83、HLA?DR均表达良好，具备较强的刺激淋巴细胞增殖的能力，且能诱导抗原特异性和MHC限制性的细胞免疫。结论 BA46基因转染法成功制备DCs，并诱导特异的细胞免疫，为乳腺癌的DCs基因疗法打下基础。
【关键词】 树突状细胞 BA46 腺相关病毒 乳腺癌
0 引言
树突状细胞(DCs)是人体内功能最强大的抗原递呈细胞，在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用，采用体外培养DCs，特异肿瘤抗原刺激制备DCs疫苗，免疫机体从而激发特异的细胞免疫有望成为一种理想的肿瘤手段[1, 2]。此疗法的关键是获得特异的肿瘤抗原，并将该抗原转导DCs。乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，BA46几乎在所有的乳腺癌细胞高表达，而在乳腺以外的正常组织内不表达[3?6]，以其抗原肽免疫转基因鼠，可在其身上诱导出特异的细胞免疫[7]。因此它可做为乳腺癌DCs治疗非常理想的肿瘤抗原。本研究以腺相关病毒（AAV）为载体，成功制备高滴度的携带BA46基因的重组腺相关病毒（rAAV/BA46/Neo病毒）[8]。在此基础上，取人外周血单个核细胞（DCs前体细胞），体外培养，以rAAV/BA46/Neo病毒转染DCs前体细胞，GM?CSF、IL?4和TNF?α诱导DCs成熟，加入T细胞，GM?CSF和IL?2诱导，最终获得针对BA46的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，并检测该CTL对BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T的杀伤效果及CTL 细胞中IFN?γ和IL?4的表达情况，探讨此基因转染法制备DCs，诱导特异细胞免疫的可行性。
1 材料与方法
１．１ 病毒 重组乳腺癌BA46基因腺相关病毒（rAAV/BA46/Neo）由作者于阿肯色大学医学院基因治疗中心制备，病毒滴度为1×1010个病毒颗粒/ml[8]。
１．２ 主要试剂 AIM?V培养基购自GIBCO invitrogen公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自Sigma公司；AIM?V (R)无血清淋巴细胞培养基购自GIBCO Invitrogen公司；GM?CSF购自Immunex公司；IL?4购自R&D SYSTEMS公司；FITC标记的Anti?CD40抗体购自Immunotech公司；FITC标记的anti?CD80、anti?CD83、anti?HLA?DR、anti? IFN?γ和PE标记的anti?IL?4均购自Becton?Dickinson公司；FITC标记的anti?CD86购自Pharmingen公司。
１．３ 主要仪器 流式细胞仪为美国Becton Dickinson 公司产品；液闪计数仪为美国Backman公司产品。
1．4 人外周血DC的培养 取健康人外周血50ml，Ficoll分离，收集淋巴细胞，以AIM?V为培养基，调节细胞浓度为109/ml，培养于6孔板，每孔2.5ml，在 37℃、5% CO2孵箱中培养，贴壁5h，轻轻洗去悬浮的淋巴细胞，取贴壁的单个核细胞，每孔加2.5ml含GM?CSF（终浓度为800U/ml）的AIM?V培养基，将细胞分为基因转染组和对照组(未感染病毒组)，基因转染组每孔加rAAV/BA46/Neo病毒液0.5ml，感染5h后换液为每孔3ml含GM?CSF（终浓度为800U/ml ）的AIM?V培养基，对照组每孔只加293细胞冻融液0.5ml。两组细胞均于第2天半量换液，于第3天全量换液为含GM?CSF（终浓度分别为800U/ml）和IL?4（终浓度为1 000U/ml）的AIM?V培养基。而后隔天半量换液，培养基均为含GM?CSF（终浓度分别为800U/ml）和IL?4（终浓度为1 000U/ml）的AIM?V。 第5天，除了GM?CSF和IL?4外，还加入TNF?α（终浓度为20ng/ml）。第7天，收集细胞，计数，光学显微镜下观察DCs形态。
1.5 CTL的诱导 在6孔板内，以含5%人血清的AIM?V为培养基，按DCs∶T细胞＝1∶20的比例混合DCs和T细胞，同时加入GM?CSF（终浓度分别为800U/ml）和IL?2（终浓度为200U/ml），共培养7天，期间每隔1天均半量换液。
1.6 混合淋巴细胞反应(MLR) 取上述外周血分离非贴壁细胞置培养瓶中，用含终浓度500u/ml 的IL?2，10%人AB血清的AIM?V培养液于37℃、5% CO2培养箱中培养。待DC成熟后，将非贴壁细胞加在分别取培养7ｄ的基因转染组DCs以及培养同样时间对照组DCs用25μg/ml的丝裂霉素C在37℃孵育45min，PBS液洗3次，用AIM?V培养基悬浮。分别以1×104/孔、5×103/孔和2.5×103/孔，将DCs加入96孔板中，每组各3个复孔，每孔再加入自体Ｔ细胞1×105细胞/孔，终体积为200μl。37℃，5% CO2培养96ｈ。终止培养前18ｈ加入3H?TdR，终浓度为1μC/ml，同时设阴性对照组（淋巴细胞对照组，N?DC组）及本底组。收集细胞,液闪计数仪检测cpm值，并刺激指数SI，SI=(实验组cpm值-本底组cpm值)/( 阴性对照组cpm值-本底组cpm值)，结果用3孔均值表示。
1.7 FACS分析所制备的DC的表面标志和CTL 细胞中IFN?γ 和IL?4的表达情况[9] 分别取细胞数为106/管的基因转染组DCs和对照组DCs置于流式细胞仪专用试管中，每组取4管，PBS洗涤2遍后，100μl重悬细胞，分别加入下列FITC标记的鼠源性单抗：对照isotype、anti?CD40、anti?CD80、anti?CD86、anti?CD83、anti?HLA?DR，避光反应45min，PBS洗涤2遍后，流式细胞仪检测其细胞表面标志表达情况。参照Pala等[9,11]的方法处理诱导的CTL，加入终浓度分别为50ng/ml和500ng/ml的PMA和Ionomycin，在37℃的CO2孵箱培养6h，收集细胞，计数。室温下，2%聚甲醛处理20min固定细胞，以含1% BSA/0.5%皂甙的PBS液，室温下处理10min，加入对照isotype和FITC标记的鼠源性单抗anti?IFN?γ以及对照isotype和PE标记的鼠源性单抗anti?IL?4，流式细胞仪检测其IFN?γ、IL?4表达情况。
1.8 51Cr释放法测量DC激活的T细胞对BA46阳性细胞株的杀伤效率[11] 分别以基因转染组ＤＣ激活的T细胞和对照组ＤＣ激活的T细胞为效应细胞，收获对数生长期的BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs578T为靶细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，取0.5ml细胞悬液，加入100uCiNa251CrO4，37℃共育2h。洗涤后稀释至106/ml，在U形板中加入100ul细胞悬液，按照20∶1的效靶比加入CTL细胞。37℃共育6h。收获100μl上清，γ计数仪计算，同时设51Cr自发释放组及完全释放组。按下列公式计算杀伤率：
细胞毒活性（%）＝试验组CPM值－自发释放CPM值最大释放CPM值－自发释放CPM值×100%
同时取K562细胞为靶细胞进行同样的细胞毒试验以研究T细胞的非特异杀伤情况。在基因转染组CTL杀伤Hs578T的细胞毒试验中增加一组实验，即靶细胞与Na251CrO4共育并洗涤后，加入HLA?I类抗体W6/32（终浓度为50μg/mL）共育1h，使其MHC受到封闭后，再进行细胞毒试验，研究T细胞杀伤的MHC限制性。
2 结果
2.1 携带有BA46基因的重组rAAV/BA46/Neo病毒结构示意图 AAV的rep及cap基因被BA46和Neo基因取代，保留两端的反向未端重复序列（ITR），BA46基因采用P5启动子，Neo基因采用SV40启动子，见图1。
图1 携带有BA46基因的重组rAAV/BA46/Neo病毒结构图（略）
2.2 基因转染组成熟DCs形态 第7天，光镜下观察基因转染组DCs，可见DCs(图中箭头所示)，外形不规则，细胞表面有大量长短不一的突触，呈现典型的DC形态，见图2。BA46基因成功转染DC并表达见相关文章[7]。
图2 基因转染组成熟DC形态（略）
2.3 FACS分析两组DC表面标志表达情况 FACS结果显示，基因转染组DCs共刺激因子CD80（B7?1）、CD86（B7?2）、CD40、CD83、HLA?DR的表达比例分别为78%、83%、79%，86%、92%，均高于对照组DC的15%、64%、53%、74%、89%。
2.4 混合淋巴细胞反应(MLR)情况 基因转移组DCs能明显促进T细胞增殖，其诱导自体CTL的刺激指数（SI）明显高于裂解物刺激组DCs诱导自体CTL的刺激指数, 见表1。
表1 两组DCs诱导CTL的刺激指数（略）
2.5 FACS分析两组DCs激活的T细胞中IFN?γ和 IL?4的表达情况 FACS分析两组DCs激活的T细胞亚群中，基因转染组的IFN?γ和 IL?4表达分别为23.8%和1.7%，而对照组DC激活的T细胞的IFN?γ和 IL?4表达分别为19.4%和13.2%。
2.6 51Cr释放法测量DCs激活的T细胞的杀伤效率 DCs激活的T细胞的细胞毒试验结果, 见表2。
表2 DC激活的T细胞的杀伤效率（略）
*与对照组相比P＜0.001
由表1可知，基因转染组T细胞对BA46阳性的靶细胞Hs578T有明显的杀伤（48.5%），而裂解物刺激组T细胞对同样靶细胞无明显杀伤（7.8%），两者比较有显著性差异。而且，当加入MHCI类抗体W6/32时，基因转染组T细胞对Hs578T的杀伤率明显下降，仅为12.3%，说明MHCI类抗体可封闭该杀伤活性，杀伤具有MHC限制性；当靶细胞是BA46阴性的K562时，该T细胞对其无明显杀伤，仅为8.2%，说明了此基因转染组所诱导的T细胞对Hs578T的杀伤具有BA46抗原特异性。
3 讨论
乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，DCs瘤苗有望成为该病一种全新的手段，已有采用DC瘤苗治疗乳腺癌的临床试验正在进行之中[10]。制备DC瘤苗的方法常用有抗原肽直接冲击和抗原基因转染等方法，而抗原肽直接冲击存在一定的不足：（1）抗原肽有一定的半衰期（比如t1/2[Her-2/neu]≤30min），不利于多次刺激；（2）目前使用的抗原肽大多来源于细菌表达的基因工程产品，此类蛋白缺少真核细胞对蛋白翻译后的进一步修饰。而采用抗原基因转染制备DC瘤苗有望克服上述不足。
在基因转染载体的选择上，除了要求抗原基因能成功转移外，还要能长期稳定表达，所以本研究选择腺相关病毒（AAV）为载体，AAV可成功转导DC，并特异整合于人19号染色体上，从而实现转移基因的长期稳定表达[11]，我们的前期研究结果充分说明了的BA46基因能成功转移DCs，并有明确的表达[8]。
采用基因转染制备DCs，除了保证抗原基因的成功转移和表达外，基因转染后的DC是否能诱导针对抗原的特异细胞免疫是制备DC瘤苗的关键。本研究发现，以AAV为载体转移抗原基因BA46至DCs前体细胞后，不影响DC的成熟，在常规外源性细胞因子GM?CSF和IL?4的作用下，第7天的DCs即呈现典型的DC形态，外形不规则，细胞表面有大量长短不一的突触。在功能方面， CD80、CD86、CD40、CD83、HLA?DR是DC功能的重要标志，而基因转染组DCs在这些细胞表面标志均有很高比例的表达，高于对照组（采用细胞裂解物冲击制备）的DCs。
DCs功能最重要的体现是诱导T细胞，本研究采用基因转染制备的DCs具备较强的刺激淋巴细胞增殖的能力。所诱导的T细胞对抗原阳性的靶细胞具有很好的杀伤作用，而且该杀伤活性具有MHC限制性和明显的抗原特异性。
选择腺相关病毒为载体，将乳腺癌BA46基因转染树突状细胞诱导特异细胞免疫的成功，为以BA46为靶抗原的乳腺癌DCs基因疗法奠定了实验室基础。
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