葡聚糖磁流体热处理对小鼠H22移植瘤生长的影响及机制初探
【摘要】 目的 探讨磁流体热处理对小鼠H22移植瘤生长及血管内皮生长因子（VEGF）表达和凋亡状况的影响。方法 将接种了H22肝癌细胞的小鼠随机分为4组。对第4组移植瘤内注射葡聚糖磁流体，在55kHz，20kA/m交变磁场中作用10min。第1、第2、第3组作为对照，分别对瘤内注射盐水不加磁场，注射盐水加磁场和注射磁流体不加磁场。两周后处死动物，称瘤重，抑瘤率。另两组动物分别瘤内注射磁流体和等体积盐水，作为处理组和对照组，在经磁场处理后1h、5h、24h、48h和336h处死，检测瘤组织的VEGF表达和凋亡状况。结果 第4组移植瘤内的温度可达到46℃～48℃。与第1、第2、第3组相比，第4组抑瘤率分别为：59.74%、52.51%和40.35%，其中与第1组差异有显著性（P<0.05）。磁热处理后不同时间，处理组肿瘤组织的VEGF表达和凋亡状况与对照组的比较差异均无显著性。结论 单次磁流体热处理可以显著抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长。抑制VEGF表达和诱导凋亡不是抑制移植瘤生长的主要原因。
【关键词】 热处理 磁流体 抑瘤作用 血管内皮生长因子（VEGF） 凋亡
0 引言
近年来随着纳米材料与技术的，Jordan等[1]提出了“磁流体热疗”的概念。
目前磁流体热处理对肿瘤生长的抑制作用，已有一些实验证据支持，但其抑制肿瘤的分子机制和作用途径，尚不清楚。本文观察了磁热处理对H22移植瘤生长的影响以及热处理后不同时间肿瘤组织的血管内皮生长因子（VEGF）表达和凋亡状况，对磁热处理抑制肿瘤生长的机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 动物及细胞
20g左右雄性Balb/c小鼠（SPF级）购自上海实验动物中心。小鼠H22肝癌细胞株引自河北医科大学实验动物学部。
1.2 移植瘤模型的建立与处理
Balb/c小鼠后腿根外侧皮下接种H22肝癌细胞1×107/0.1ml，4d后随机分为4组，每组8只。1组注射生理盐水不加磁场；2组注射生理盐水加磁场；3组注射磁流体不加磁场；4组注射磁流体加磁场。分别对小鼠移植瘤内及瘤周分5点注射0.2ml葡聚糖磁流体（含24.16mg磁性粒子，粒子平均直径为15nm，自制）或等体积生理盐水后，置于交变磁场中（纳米超顺磁热疗仪，自制，磁场强度55kHz，20kA/m），作用一次，10min。每组随机抽取3只动物，用光纤温度计（FTI?10光信号处理器和FOT?M医用光纤温度传感器，FISO公司，加拿大）实时监测移植瘤中心部位的温度，另3只监测直肠温度。两周后处死动物，称瘤重，计算抑瘤率。
抑瘤率＝（对照组瘤重 － 处理组瘤重）/对照组瘤重×100 %
另两组动物如前法接种，分组，注射，分别瘤内注射0.2ml磁流体和等体积生理盐水，在经磁场处理后1h、5h、24h、48h和336h处死，每次3只，以注射但未经磁场处理1h后的动物作为对照，检测组织中的VEGF表达和凋亡情况。
1.3 组织学观察
对肿瘤组织的石蜡切片做HE染色后，进行组织学观察。
1.4 VEGF表达检测
1.4.1 免疫组化法 对肿瘤组织的石蜡切片做免疫组化检测。一抗为兔抗小鼠VEGF多抗（购自友谊中联生物科技有限公司），二抗为生物素标记的羊抗兔IgG（购自华美生物工程公司）。以磷酸盐生理盐水缓冲液（PBS）代替一抗作为对照。
1.4.2 流式细胞分析 将肿瘤组织研过铜网，用PBS缓冲液制成细胞悬液，调细胞浓度为1×106/ml，加入兔抗小鼠VEGF抗体，作用1h，PBS洗3次，加入FITC?羊抗兔IgG（购自华美生物公司）30min，PBS洗3次，过滤，上机检测。（FACS Aria 流式细胞分析仪，BD公司，USA，激发光波长488nm），以PBS代替一抗作为对照。
1.5 凋亡检测
1.5.1 原位凋亡检测 对肿瘤组织的石蜡切片做原位凋亡检测，TUNEL法（TUNEL试剂盒购自华美生物公司）。
1.5.2 流式细胞分析 肿瘤组织用PBS研过铜网制成细胞悬液，调细胞浓度为1×106/ml，加入碘化丙啶（PI）染色，过滤，上机检测。
2 结果
2.1 磁热处理对移植瘤生长的影响
磁流体加磁场组瘤内温度可以达到46℃～48℃。磁热处理后各组的瘤重，见表1。与3个对照组比较，磁流体加磁场组抑瘤率均大于30%，但只与盐水组比较，差异有显著性P<0.05。
表1 经磁热处理后各组的瘤重（略）
1. 注射生理盐水；2. 注射生理盐水加磁场；3. 注射磁流体；4. 注射磁流体加磁场（*P<0.05）
2.2 组织学检测
瘤内注射后磁流体可以渗透到临近的肿瘤组织中，但分布不是很均匀。磁流体本身没有引起组织细胞坏死。比较磁热处理1h和48h后的组织切片，可见，处理后随时间推移，坏死的组织面积增大。与注射盐水加磁场处理后48h时的组织相比，注射磁流体加磁场作用48h后，坏死的肿瘤组织面积大，且主要分布在磁流体周围。各组肿瘤组织的HE染色结果，见图1。
2.3 VEGF检测
2.3.1 免疫组化法
检测磁热处理后，不同时间点移植瘤组织中的VEGF表达情况，可见，注射磁流体组与注射盐水组表达强度差异并不显著。磁热处理24h后组织的VEGF表达，见图2。
2.3.2 流式细胞分析
分别检测磁热处理1h、5h、24h、48h和336h后，盐水加磁场和磁流体加磁场组肿瘤组织中VEGF的表达情况，结果见图3。不同时间点间差异无显著性。相同时间点，各处理组与对照组表达量比较，差别均无显著性，与免疫组化的检测结果一致。
图3 流式细胞分析经磁场处理后肿瘤组织的VEGF表达情况（略）
2.4 凋亡检测
2.4.1 原位凋亡检测 磁热处理后不同时间点，磁流体加磁场组与盐水加磁场组和磁流体组比较，凋亡细胞数基本相近。磁热处理后48 h组织的原位凋亡情况，见图4。
2.4.2 流式细胞分析
分别检测磁热处理后1h、5h、24h、48h和336h盐水加磁场和磁流体加磁场组肿瘤组织中的凋亡百分比，结果见图5。
图5 流式细胞分析经磁场处理后肿瘤组织的凋亡情况（略）
3 讨论
热疗用于肿瘤已有悠久的。本文结果也支持单次磁流体热处理（46℃～48℃）可以抑制移植瘤的生长。从解剖和切片观察可见，磁流体还不能均匀地渗透、分布到整个移植瘤内，因此热处理组抑瘤的均一性较差，只与盐水组比较有显著差异，而与注射磁流体组和注射盐水加磁场组的差异没有显著性，与Jordan等[1]的实验结论一致。
Vertrees等[2]将正常人支气管上皮细胞BEAS2?B和其相应的恶性细胞BZR?T33，分别在43℃处理180min。与正常细胞相比，处理7天后，恶性细胞存活率低，成瘤性差，凋亡比例增加。但是，关于热处理是否导致肿瘤细胞凋亡目前也有不一致的看法。Nakahata等[3]对几种正常二倍体细胞和肿瘤细胞做43℃、2h处理，发现随热处理后时间的延长，具有多个核仁的肿瘤细胞增多，虽然从核的形态看这些细胞像是凋亡细胞，但热处理后4d内没有检测到DNA梯带，原位凋亡检测也未见凋亡信号。由此推测，热处理引起的肿瘤细胞死亡不是由于凋亡而是与有丝分裂紊乱有关[3]。由本文结果可见，46℃～48℃处理两周后，肿瘤组织的凋亡率与对照组相比差异并无显著性。在热处理后不同时间点检测肿瘤组织的凋亡情况，与对照组比较差异均无显著性。提示启动凋亡不是细胞热敏感性的必然反应，诱导凋亡并不是磁热处理抑制移植瘤生长的主要原因。
体外实验证明，41℃处理90min，使HUVEC分泌的VEGF下降[4]。体内实验也证明热处理可以增加血管的通透性[5]。由此推测，热处理可能通过抑制血管生成来抑制移植瘤的生长。但Eikesdal等[6]对荷神经胶质瘤大鼠腹腔注射30mg/kg血管生成抑制剂Batimastat，结果显示Batimastat单独或与热疗联合使用均不能抑制肿瘤生长。我们分别检测了热处理后不同时间肿瘤组织的VEGF表达情况，与对照组相比均无显著改变。VEGF是促进血管生成的特异性作用因子，提示，抗血管生成作用不是磁热处理抑制移植瘤生长的主要原因。
Nikfarjam等[5]以CBA鼠的正常肝组织和结肠癌肝转移组织做为研究对象，分别在热处理（2W，50秒，100焦耳）后24h、48h、72h、120h和168h观察组织的坏死、血管损伤和凋亡情况。结果表明，局部热处理使得瘤组织血流量降低，血管通透性增高，会立即引起微血管损伤和组织坏死[5，7]，并使凋亡水平增高[8]。热处理结束后仍可见渐进性的组织和血管损伤增加，血管损伤早于组织损伤[5]，而凋亡状况比较稳定[8]。这个结果与我们观察到的肿瘤组织中坏死的面积随时间的延长有所增加的结果和凋亡比例随时间变化的趋势一致。由此推测，本文中磁热处理后短暂的VEGF表达下降可能主要是因组织、血管的坏死引起的。磁流体热处理抑制移植瘤生长的主要原因可能是导致组织坏死。
热疗抑制肿瘤的方法由来已久，但局部热疗引起组织损伤的确切机制或说是热疗抑制肿瘤生长的确切机制还尚无定论[7]。磁热疗的机制也如此。而且，体外实验显示，磁性粒子本身就可以抑制体外培养的人成纤维细胞增殖，降低细胞存活率[9]，诱导Hep?6肝癌细胞凋亡[10]，使细胞裂解[11]。虽然从本文切片观察，磁流体注射到移植瘤内后，未见磁性粒子进入细胞内；从抑瘤效果看，单独注射磁流体组与注射盐水组之间差异也没有显著性，但也不能完全排除，磁流体本身对移植瘤的生长也有一定的抑制作用。因此，磁性粒子对组织、细胞的影响还有待更长期、深入的观察。磁流体热处理抑制肿瘤生长的机制还有待进一步研究。
4 结论
单次磁流体热处理（46℃～48℃）可以显著抑制小鼠H22移植瘤的生长。诱导凋亡和抑制VEGF表达不是磁热处理抑制移植瘤生长的主要原因。
【】
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