胰岛素对化疗药物5?氟尿嘧啶的增效作用及其机制
【关键词】 胰岛素
Insulin?induced Enhancement of Chemotherapeutic Response of 5?Fluorouracil and Its Mechanism
Abstract：Objective To observe whether insulin can induce an enhancement of chemotherapeutic response of 5?fluorouracil (5?Fu) on human transplantable esophageal cancer nude model and study the mechanism of action. Methods The expression of cyclin D1 in tumor tissue was tested by immunohistochemistry. Murine serum insulin?like growth factor1(IGF?1) and insulin?like growth factor binding protein3(IGFBP?3) were determined by ELISA. Results High, medium and low dose insulin (0.09,0.06,0.03u/20g) combined with 5?Fu could inhibit the growth of tumor greatly(P<0.05) but without severe side effects of 5?Fu.Compared with control group, the expression of cyclin D1 increased significantly in insulin group(P<0.05). There was not a statistical significance on the levels of serum IGF?1 and IGFBP?3 between combination groups and 5?Fu alone group (P>0.05). Conclusion Insulin can enhance the chemotherapeutic response of 5?Fu on human transplantable esophageal cancer nude model. The increased expression of cyclin D1 plays an important role in the enhancement. The change of levels in serum IGF?1 and IGFBP?3 fails to elucidate the mechanism of enhancement.
Key words：Insulin; 5?Fluorouracil；Enhancement
摘要：目的 建立裸鼠人食管癌模型，观察胰岛素是否增强5?氟尿嘧啶（5?Fu）对裸鼠的化疗疗效并探讨其机制。方法 免疫组织化学方法检测肿瘤组织中Cyclin D1的表达。ELISA方法检测裸鼠血清中胰岛素样生长因子（IGF?1）和胰岛素样生长因子结合蛋3（IGFBP?3）含量变化。结果 大中小剂量胰岛素(0.09、0.06、0.03u/20g)均可明显增强5?Fu的抑瘤作用(P<0.05)，但并不增加5?Fu的毒副反应。胰岛素组与对照组相比，Cyclin D1表达水平明显增多(P<0.05)。5?Fu组和联合用药组之间 IGF?I和IGFBP?3水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在裸鼠人食管癌模型中，胰岛素能增强5?Fu对裸鼠人食管癌移植瘤的化疗疗效，Cyclin D1表达水平增多在胰岛素增效机制中发挥着重要作用。而血清中IGF?I和IGFBP?3含量变化尚不能解释其增效机制。
关键词：胰岛素； 5?氟尿嘧啶； 增效
0 引言
寻找和发现能够增加肿瘤对化疗药物敏感性的化疗增效剂，使化疗药物能更大程度的提高疗效并减少毒副反应,是恶性肿瘤急需解决的问题。
本实验在体外实验的基础上，建立裸鼠人食管癌模型，从体内观察胰岛素对化疗药物5?氟尿嘧啶（5?Fu）的增效作用并探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株和动物
人食管鳞癌细胞EC109来源于医学院肿瘤研究所，由我院肿瘤病理重点实验室传代保存。裸鼠(BALB/c品系，8周龄，雄性)，由中科院上海动物所裸鼠室提供。培养液均为10%胎牛血清的RPMI 1640液，洗涤液为RPMI 1640液，培养条件为5% CO2、37℃培养。
1.1.2 药品及试剂
5?Fu（10ml∶0.25g），由上海旭东海普药业有限公司生产，批号为：040108；葡萄糖注射液（20ml∶10g）,由河南开封制药厂生产，批号为：031213；胰岛素注射液（10ml∶400单位）由江苏万邦生化医药股份有限公司生产，批号为：0406206。
1.2 实验方法
1.2.1 动物实验
每只鼠背部皮下注射大约0.2ml无菌EC109细胞悬液(含6.0～8.0×106 细胞)，接种后每2d用游标卡尺测量瘤体最长径a与最短径b，肿瘤体积V=1/2ab2,一周后待肿瘤体积长至约0.2cm3后随机分为六组。每组裸鼠数为10只。具体处理如下：为防止低血糖的发生，每只小鼠按0.5ml/20g 灌胃50％G?S。胰岛素大中小剂量分别按0.09、0.06、0.03u/20g左侧腋下注射，5?Fu按10 mg/kg腹腔注射，胰岛素提前30min给药。每天用药一次，连用8d。末次用药后第2d将小鼠处死。各组动物眼眶后静脉丛取血10μl,测定红细胞(RBC)、血小板(PLT)及白细胞(WBC)量,取出肿瘤称重,按如下公式计算抑瘤率。抑瘤率(%)=对照组平均瘤重-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重×100%。收集血清，并将新鲜肿瘤标本置液氮中保存[1,2]。
1.2.2 用免疫组织化学法检测肿瘤组织中Cyclin D的表达
采用免疫组化SP染色法，步骤按北京中山SP免疫组化试剂盒说明书进行。用低倍镜选择背景清晰、对比满意的区域，每张切片随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，取其均数。并用10％的中性福尔马林固定胰腺组织，作HE染色。
1.2.3 用ELISA方法检测血清中IGF?1和IGFBP?3的含量
每只鼠处死前取外周血约1ml,靜置后取上清，采用武汉博士德鼠胰岛素样生长因子1（IGF?1,BOSTER,EK0378）和胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP?3,BOSTER,EK0387）检测试剂盒，具体按说明书进行。
2 实验结果
2.1 观察胰岛素联合5?Fu对裸鼠人食管癌模型的抑瘤作用
大中小剂量胰岛素联合5?Fu均能明显增加单用5?Fu 时的抑瘤作用(P<0.05)，大中小剂量胰岛素对5?Fu的增效作用之间无统计学差异(P>0.05)，见表1。
2.2 对毒副反应进行监测
2.2.1 与对照组相比，单用5?Fu组和胰岛素+5?Fu组中，白细胞数明显下降（P<0.01），但单用5?Fu组和胰岛素+5?Fu组之间白细胞数差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。
2.2.2 用HE染色法观察胰腺的形态学改变,结果显示：单用5?Fu 组和联合用药组间差别无统计学意义(P>0.05)，见图1。
表1 胰岛素和5?Fu对裸鼠人食管癌肿瘤的抑制作用（略）
△P<0.05 vs Control; ▲P<0.05 vs 5?Fu alone
表2 胰岛素和5?Fu对裸鼠人食管癌模型外周血象的影响（略）
△P<0.01 vs Control
表3 ELISA方法检测裸鼠人食管癌模型血清中IGF?1和IGFBP?3的含量（略）
△ P<0.01vs Control; ▲ P<0.05 Control vs Normal mice； * Normal mice: Healthy mice (male,20±2g) without tumor
2.3 对胰岛素增效机制进行探讨
2.3.1 Cyclin D1的阳性表达位于胞浆和胞核，对照组和胰岛素组中Cyclin D1的阳性表达率分别为33%和58%，两组对比有统计学意义(P<0.05)。
2.3.2 ELISA方法检测裸鼠血清中IGF?I和IGFBP?3含量变化
与正常鼠相比，对照组中小鼠血清中IGF?I 水平升高, IGFBP?3水平降低(P<0.05)；处理组5?FU 组和联合用药组血清中IGF?I水平明显低于对照组(P<0.01)。但5?FU 组和联合用药组之间IGF?I 和IGFBP?3水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。
2.4 统计分析
应用SPSS11.0软件进行分析，各实验组和对照组间的数据进行单因素方差分析，以P<0.05作为有统计学意义的检验水准。
3 讨论
已证实：生长缓慢，生长分数低的肿瘤对化疗敏感性差；而生长快，生长分数高的肿瘤却有较好的化疗敏感性[3]。生长快的肿瘤细胞多处于增殖周期，分裂增殖活跃，代谢旺盛，对化疗药物敏感；而生长缓慢的恶性肿瘤较多的肿瘤细胞处于非增殖周期，受细胞毒药物的影响也较小。胰岛素是一种代谢促进剂，可以提高细胞和组织的代谢水平。另一方面，它还可以促进RNA和DNA的合成，刺激正常细胞和肿瘤细胞的生长增殖，诱导肿瘤细胞进入增殖周期[4?7]。
合理地使用促代谢剂胰岛素，将肿瘤细胞调整到代谢旺盛，分裂增殖活跃的状态，能够增加肿瘤组织对化疗药物的敏感性。本实验模仿临床用药，结果显示：裸鼠人食管癌模型，胰岛素可增强5?Fu的化疗效果。增效的过程毒性并不增加。这与以往的体外研究结果一致[8,9]。
细胞周期蛋白D与其相应的细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6结合形成CDK4?cyclin D1和CDK6?cyclin D1复合体，在细胞通过G1期进入S期的过程中起着关键的作用[10]。本实验结果显示：受到胰岛素刺激的裸鼠实验组，其Cyclin D1的表达明显增多。由此推断：胰岛素是通过或者说至少是部分通过增加细胞周期蛋白D的表达而使大量肿瘤细胞其中包括一些G0期细胞迅速通过G1期限制点进入S期的。通过胰岛素的作用，使肿瘤细胞G1期持续时间缩短，进而缩短了整个细胞增殖周期。并使更多的细胞处于细胞周期中合成代谢旺盛的S期，提高了肿瘤组织的代谢水平，此时加入S期特异性化疗药物5?Fu能够更加有效地杀伤肿瘤细胞。这可能是胰岛素发挥化疗增效作用的主要原因之一。
IGF系统及其结合蛋白与肿瘤的关系是近年研究的热点,许多流行病学研究表明，循环中IGFs水平的升高及IGFBP?3水平的降低与前列腺癌、绝经前妇女乳腺癌、结肠癌及肺癌的发病率呈明显相关性。IGF?I 和IGFBP?3在细胞生长和肿瘤形成中发挥着重要作用[11]。胰岛素的生物学效应类似于IGF?I,这些效应通过胰岛素受体和IGF?I受体发挥作用。许多实验资料显示IGF?I能影响细胞毒药物的疗效并在耐药过程中发挥着重要作用。本研究中，与正常鼠相比对照组裸鼠血清中IGF?I水平升高, IGFBP?3水平降低(Ｐ<0.05)，处理组血清中IGF?I水平明显低于对照组(P<0.01)。这些结果与Sohda M等[12]的研究一致。这说明IGF?I 水平升高IGFBP?3水平降低在肿瘤形成过程中发挥着重要作用。但5?Fu组和联合用药组之间 IGF?I 和IGFBP?3水平差异无统计学意义(P>0.05)。可能动物数目有限，研究结果示尚不能用血清中IGF?I 和IGFBP?3含量变化来解释其增效机制。
胰岛素是临床常用的药物，结合适量的葡萄糖输注，使用安全，价格便宜，而且对正常细胞无毒副作用。实验结果显示：在裸鼠人食管癌模型中，胰岛素可增强5?Fu的化疗效果。增效的过程毒性并不增加。本实验的研究结果初步证实“提高肿瘤代谢水平可以增加肿瘤对化疗药物的敏感性，提高化疗以及包括化疗在内的肿瘤综合的疗效”，为提高临床肿瘤化疗效果提供了新的思路。
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