抗VEGF抗体及抗KDR抗体对裸鼠胃癌细胞增殖和凋亡的影响
【关键词】 抗体
The Effect of Anti?vascular Endothelial Growth Factor and Receptor Antibody on the Proliferation Activity and Apoptosis of Human Gastric Cancer
Abstract：Objective To study the inhibiting effect of anti?vascular endothelial growth factor and receptor antibody on growth、metastasis and apoptosis of gastric cancer. Methods The inhibitory effect of anti?VEGF antibody, anti?KDR antibody were investigated by means of an orthotopic xenotransplanted model of mice which had been randomly divided into 4 groups: ①control group, ②group receiving anti?VEGF antibody, ③group receiving anti?KDR antibody and ④group receiving anti?VEGF antibody and anti?KDR antibody. Anti?VEGF antibody and anti?KDR antibody was given i.p. twice a week for 8 weeks from day 7 after transplantation.All animals were sacrificed at the end of 10 weeks. The tumor was weighted and the expression level of VEGF mRNA and protein were examined in antisense group by RT?PCR analysis and immunohistochemistry respectively. Apoptotic cell and cell cycle were detected in transfected cells by FCM assay. Results The decreased expression levels of VEGF protein were found in anti?VEGF antibody group,anti?KDR antibody group, anti?VEGF antibody and anti?KDR antibody group. Apoptotic cells were found in three groups’cells. G0/G1 phase cells were increased and S phase cells were decreased in cell cycle. Conclusions Both blockadiage of VEGF with anti?VEGF antibody and VEGF?binding site with anti?KDR antibody could inhibited gastric cancer. cells growth,which might provide a new approach to the treatment of gastric cancer.
Key words：Gastric cancer；Vascular endothelial growth factor；Receptor of KDR
摘要：目的 探讨抗VEGF抗体及抗KDR抗体对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 建立胃癌原位种植模型；7天后注射抗VEGF抗体、抗KDR抗体及二者联合注射，连续给药8周，每周2次，第10周末处死动物，用免疫组化法、RT?PCR法检测移植瘤组织中VEGF蛋白和mRNA表达情况；FCM检测肿瘤细胞增殖及凋亡情况。结果 与对照组相比，抗VEGF抗体和抗KDR抗体组肿瘤组织中VEGF蛋白的表达降低，而VEGFmRNA表达无显著变化；肿瘤细胞发生不同程度的凋亡，凋亡率明显增高，G0/G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少，细胞增殖指数降低；两者合用时作用更为明显。结论 通过中和VEGF抗体和封闭KDR受体抑制血管形成，可能为胃癌的抗血管生成提供依据。
关键词：胃癌；血管内皮生长因子；KDR受体
0 引言
机体内实体肿瘤直径超过1～2mm时，必须有新生血管的生成，它是肿瘤生长和转移的前提[1, 2]。血管内皮细胞生长因子(VEGF)能特异性地作用于血管内皮细胞，促进其分裂增殖。VEGF通过作用于细胞上两个特异性受体FLt和KDR发挥其生物学作用[3]。抗VEGF抗体能够明显抑制裸鼠皮下肿瘤的生长[4, 5]。本研究将不同浓度的抗VEGF抗体和抗KDR抗体加入胃癌细胞，观察其对胃癌细胞在裸鼠体内增殖和凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 人胃癌BGC－823细胞(河北医科大学第四科研中心提供)；抗VEGF单抗、兔抗KDR多抗，抗IgG单抗(Oncogene公司)；Trizol（GIBCO公司）；SABC免疫组化试剂盒、DAB试剂盒（武汉博士德公司）；RT?PCR试剂盒（北京华美生物公司）。
1.2 细胞培养 BGC?823细胞用含10%小牛血清的RMPI1640培养基在5%CO2，37℃条件下进行培养。
1.3 裸鼠胃癌原位种植模型制备及标本采集 40只BABL/c/nu裸鼠，雌性，4～6周龄，SPF室中饲养。将对数期细胞制成悬液，浓度为1×107/ml。将含2×106细胞的悬液接种裸鼠前肢腋下（200μl/只），每组10只。以皮下瘤结节直径超过0.5cm为成瘤标准。接种后第7天起，注射给药8周，2次/周。抗VEGF组（BGC?823?V group）：抗VEGF抗体每次每只50μg。抗KDR组（BGC?823?K group）：抗KDR抗体每次每只50μg。抗VEGF＋抗KDR组（BGC?823?VK group）：抗VEGF抗体每次每只50μg。抗KDR抗体每次每只50μg。对照组（BGC?823 group）：PBS液每次每只50μg。第10周末处死动物，切除肿瘤，观察肝脏转移情况。将一部分标本福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋。另一部分标本用OCT包埋液氮速冻后?70℃保存备切片。
1.4 VEGF蛋白及mRNA表达的检测 ①免疫组化检测：采用SABC法，组织切片脱蜡、水化后，用3%过氧化氢去除内源性酶，微波抗原修复；加入兔抗人VEGF抗体。DAB显色，苏木精复染，光镜观察结果。分别用已知阳性的胃癌组织切片作阳性对照，正常小鼠和兔血清及PBS代替一抗作阴性对照。 细胞浆或核呈棕黄色颗粒状分布者为阳性染色。阳性染色细胞≤10%者为阴性表达，细胞阳性染色>10%者为阳性表达［7］。②RT?PCR检测：VEGF上游引物序列：5’?GAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC?3’；下游引物序列：5’?CGATCGTTCTGTATCAGTCTTTCC?3’；取100mg肿瘤组织标本用Trizol试剂提取总RNA。进行RT?PCR反应，反应总体积为30μl，应用β?actin作为内对照。反应条件：37℃ 60 min，94℃变性5 min，94℃ 30 s、72℃ 45 s、58℃ 30 s（循环35次），延伸72℃ 5 min。取扩增产物，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，经EB染色，用凝胶成像分析系统分析结果并目的基因片段的相对表达值。计算方法为：VEGFmRNA相对表达值＝VEGF吸光值/β?actin吸光值。
1.5 流式细胞术检测肿瘤细胞增殖和凋亡情况 取对数期各组细胞制成悬液，70%冷乙醇固定过夜，经EB染色后用流式细胞仪进行细胞增殖指数（PI）、凋亡率（APOI）和周期分布分析。
1.6 统计学分析 应用SPSS11.5软件进行统计处理。
2 结果
2.1 裸鼠胃癌模型建立 所有种植的肿瘤均有生长，抗VEGF组、抗KDR组肿瘤重量均较对照组轻(P<0.05)，二者合用组肿瘤最小，抗VEGF组与抗KDR组之间无显著差异。转移模型可见腹膜，区域淋巴结，肝脾等广泛转移。抗VEGF抗体及抗KDR抗体能有效抑制肝转移，在两者合用组未见1例肝转移发生，见表1。
表1 不同组别移植瘤生长和转移情况（略）
*与对照组相比有显著性差异
2.2 肿瘤组织内VEGF蛋白和mRNA的表达变化 ①免疫组化：抗VEGF组、抗KDR组、抗VEGF＋抗KDR组裸鼠的肿瘤组织中VEGF阳性表达率分别为30%（3/10）、20%（2/10）、10%（1/10），显著低于对照组（80%，8/10）；三组染色强度也显著低于对照组（图略）；②RT?PCR：抗VEGF 组、抗KDR组、抗VEGF＋抗KDR组内源性VEGFmRNA的表达与对照组相比无明显差异，结果见图1、表2。
图1 RT?PCR法检测不同组移植瘤VEGF mRNA表达情况（略）
1：DNA marker；2：BGC?823 cells；3：BGC?823?V cells；4：BGC?823?K cells；5：BGC?823?VK cells
2.3 肿瘤细胞增殖、凋亡和周期分布的检测：抗VEGF 组、抗KDR组、抗VEGF＋抗KDR组裸鼠体内BGC?823细胞增殖指数明显低于对照组和空载体组，有显著性差异（P<0.01）。抗VEGF组、抗KDR组、抗VEGF＋抗KDR组细胞发生凋亡，其凋亡率明显增高，G0/G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少，与对照组相比有显著性差异（P<0.01），见表2、3、4，图2。
图2 FCM检测不同组移植瘤细胞凋亡情况（略）
表2 不同组移植瘤VEGFmRNA表达情况比较（略）
*与对照组（BGC?823组）相比有显著差异
表3 不同组凋亡指数和增殖指数情况（略）
*表示与其他组相比P<0.05
表4 不同组细胞周期分析（略）
*表示与其他组相比P<0.05
3 讨论
VEGF可促进内皮细胞分裂增殖,提高微血管通透性。研究表明，VEGF及其受体在胃癌组织中呈高表达[6,7]，可能对胃癌血管生成，浸润转移起重要作用。肿瘤的抗血管生成疗法主要分为三方面：(1)对抗VEGF，降低其表达水平；(2)对抗VEGF受体(KDR和Flt?1)，降低其浓度及与VEGF的亲和力；(3)将抗肿瘤药物结合于VEGF的单克隆抗体上，破坏肿瘤血管内皮细胞及肿瘤细胞 [8]。因此研究抗VEGF抗体及受体抗体对胃癌的抑制作用有重要临床意义。我们在预试验中证实高浓度的抗VEGF抗体及抗KDR抗体能抑制BGC?823细胞的生长，随着抗体浓度的下降，抑制作用逐渐减弱。本试验发现注射抗VEGF抗体及抗KDR抗体后胃癌细胞在裸鼠体内形成的瘤体重量降低，二者合用组效果更明显。这可能是因为抗VEGF抗体及抗KDR抗体可中和胃癌细胞分泌VEGF以及封闭KDR受体活性，使VEGF的作用明显减弱，从而导致裸鼠体内血管生成减少，显著减少了对肿瘤的供养，抑制了肿瘤的生长。反之，对照组裸鼠胃癌细胞的VEGF分泌量增加，从而诱导体内血管大量的增生，促进了肿瘤的生长。通过免疫组化及PT?PCR检测发现，注射抗VEGF抗体及抗KDR抗体的肿瘤组织中VEGF蛋白表达水平均明显低于对照组，而内源性VEGF mRNA表达无明显变化，说明抗VEGF抗体及抗KDR抗体有效地抑制了VEGF的表达，但不能抑制VEGF的生成。
大量的血管生成可促进肿瘤的生长，新生血管的基底膜不完整，易为肿瘤细胞渗漏，增加肿瘤细胞转移的机会。如果抑制肿瘤的血管生成可达到抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡[9，10]。本实验FCM检测提示注射抗VEGF抗体及抗KDR抗体的细胞增殖活性明显受到抑制，并且细胞发生不同程度的凋亡，其凋亡率明显增高，G0/G1期细胞明显增多，S期细胞减少。抗VEGF抗体及抗KDR抗体的应用减少肿瘤转移率，可能是二者抑制肿瘤新生血管生成所致。上述结果提示抑制肿瘤的血管形成，就有可能阻止肿瘤生长和转移。目前通过直接阻断VEGF的结合位点来抑制肿瘤的生长将为胃癌提供一个新的研究思路。
【】
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