环氧化酶?2在食管癌中表达的初步研究
【关键词】 环氧化酶
An Initial Study on Cyclooxygenase?2 Esophagus in Esophagus Cancer
Abstract：Objective To research the cyclooxygenase?2 protein expression and its effect in the esophagus cancer. Methods 34 cases of esophagus cancer specimens were examined the expression of COX?2 by immunohistochemical method and Western blotting method. Results The significant positive rates of COX?2 expression in esophagus cancer was 71%,but the significant positive expression in the adenocarcinoma and squamous carcinoma is not significant difference.Statistics test showed that the age,gender,tissue differentiation,clinical stage(TNM) and node metastasis did not affect the COX?2 significant expression in esophagus cancer. Conclusion The COX?2 protein significant positive expression may be closely associated with the occurrence,form and development of the esophagus cancer.
Key words：Cyclooxygenase?2; Esophagus squamous cancer; Esophagus adenous cancer
摘要：目的 研究环氧化酶?2（cyclooxygenase?2, COX?2）在食管癌中的表达情况，探讨其在食管癌中作用。方法 应用免疫组织化学方法和Western blotting方法检测34例食管癌中COX?2的表达情况。结果 COX?2约在71%的食管癌中显著表达，其中鳞癌及腺癌的显著表达之间无统计学显著性差异。并且统计学检验表明肿瘤的临床病理特征中，年龄﹑性别、组织分化程度、临床分期（TNM）以及有无淋巴结转移对食管癌中的 COX?2的显著表达无明显影响。结论 COX?2在食管癌中的表达显著增高，临床意义尚未明确。
关键词：环氧化酶?2； 食管磷癌; 食管腺癌
0 引言
流行病学资料研究表明,长期坚持服用非甾体类抗炎药(non?steroidal anti?inflammatory drugs, NSAIDS)可使大肠癌的危险性降低40%～50 %［1］,使家族性腺瘤性息肉病的癌变率和死亡率降低。NSAIDS 作用机制在于抑制环氧化酶?2(cyclooxygenase?2,COX?2)的活性［2］。临床及实验研究表明，COX?2在机体大多数正常组织中无表达，但在多种肿瘤组织中表达增高。国内外已有学者开始研究COX在食管癌中的表达意义。本实验旨在研究COX?2在食管癌组织中的表达情况，并探讨其与食管癌的发生、发展与转移的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 选自本院2001年8月～2002年4月间手术切除并经病理检查证实的食管癌组织标本34例，其中鳞癌28例，腺癌6例。组织标本切除后于30min内取癌组织一块立即置入液氮中速冻后储存于-80℃冰箱保存备用，取远离癌组织(>5cm)的正常组织送病理检查,另取正常组织一小块以上述方法保存。
1.2 试剂 羊抗人COX?2多克隆抗体（购于Santa Cruz公司，美国）SP kit（购于ZYMED公司，美国），APES(Sigma 公司)。Trozol试剂(Invitrogen公司)，考马斯亮蓝G?250染料(Sigma公司)，PVDF膜（德国罗氏公司）。
1.3 辣根过氧化酶标记的SP 法 即石蜡切片常规脱蜡至水, 3%过氧化氢?甲醇封闭5min，PBS漂洗后置柠檬酸中，微波炉抗原修复5min，PBS 漂洗后依次滴加一抗4℃过夜,二抗37℃ 15min,辣根酶标记的链霉卵白素工作液15min，PBS 漂洗后DAB 显色,自来水充分冲洗终止反应,苏木素复染,脱水,透明,封片。
1.4 对照及评估方法 以平滑肌细胞和血管内皮细胞为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。按以下肿瘤细胞染色阳性率比例记分：为0计分为0，1%～10%记分为1，11%～50%记分为2，51%～80%记分为3，81%～100%记分为4。
1.5 分级标准 0（无表达），1～4(弱表达)，5～8(中等表达)，9～12(高度表达)， 5～12(显著表达)。
1.6 Western Blotting杂交 将组织制成匀浆，室温静置10min，离心后取下层酚氯仿相，提取蛋白质； 用Bradford法测定蛋白质浓度；将含等量蛋白质的样品与3×加样缓冲液以2∶1的体积比混合，煮沸5min后上样行SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常组织和癌组织同时上样做对照，同时点5μl Bio?Rad预染蛋白质标准作为分子量参照，垂直电泳分离蛋白质；将蛋白质通过电转移转至PVDF膜上；以含5%脱脂奶粉的TBS?T室温封闭2～3h，山羊抗人COX?2多克隆抗体4℃摇动过夜，辣根酶偶联的兔抗山羊IgG抗体，室温轻摇2～3h。
2 结果
COX?2的阳性染色主要是胞浆染色，其主要表达于癌组织中，而正常组织中除平滑肌细胞、血管内皮细胞外基本无表达, 以平滑肌细胞、血管内皮细胞的COX?2表达为对照标准。
COX?2在约70%的食管癌中显著表达，无统计学检验显著性差异。并且统计学检验表明肿瘤的临床病理特征中，年龄、性别、组织分化程度、临床分期（TNM）、有无淋巴结转移对食管癌中的 COX?2的显著表达无明显影响，见表1、2。
表1 COX?2在食管癌中的表达情况（略）
Western blot检测COX?2在肿瘤组织中和正常组织中的表达情况，见图1。
其中1～5 泳道为鳞癌，第6泳道为腺癌的表达情况，每一癌组织泳道配一正常组织泳道对照。 图中可见到COX?2在食管癌组织中明显表达，而正常组织中则无表达或轻微表达， Western blotting检测到COX?2的表达情况和免疫组化标本中的表达情况基本一致。
表2 食管癌COX?2显著表达与临床特征的关系（略）
图1 Western blot检测食管癌组织和正常组织COX?2蛋白表达（略）
3 讨论
环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是分解花生四烯酸(AA)、生成各种内源性前列腺素(PGs)过程中重要的限速酶。目前认为COX 有两种类型：COX?1 和COX?2。前者为结构型COX，在多数组织细胞中持续低浓度表达，并参与维持机体正常的生理功能；后者为可诱生型COX,在正常生理状态下多数组织内检测不到，而当细胞受到炎症等刺激后便开始表达合成。近年来研究表明,COX?2与一些肿瘤的发生、和转移有关［3］。
COX?2在肿瘤中的意义首先明确于结肠肿瘤和直肠肿瘤。随后的研究逐渐发现在全身其他部位的肿瘤中也有不同程度的表达。目前多数学者认为,COX?2的过度表达与肿瘤特别是消化系统肿瘤的发生、发展有密切关系［4,5］。
本研究表明COX?2在食管癌中显著表达，其中鳞癌及腺癌的显著表达分别为71%与67%，而癌旁组织中则无表达或轻微表达，这与同类研究结果一致，提示COX?2表达异常可能是食管癌发病过程中发生的重要分子改变。本研究提示COX?2 的表达程度与食管癌分化程度相关性无统计学差异，但有提示食管癌的分化程度越高，其COX?2 表达越强 ［6］，认为COX?2的表达可能主要存在于较为成熟的肿瘤细胞，其差异可能由于本组低分化食管癌例数太少，影响其统计学检验。发生淋巴结转移的患者COX?2的染色分数为5.700±0.868，而在无淋巴结转移病例中COX?2的染色分数为5.571±0.912，统计分析不支持COX?2 的表达程度与有无淋巴结转移间存在相关性，但国内有关COX?2表达与淋巴结转移的关系报道不一，具体原因尚不清楚，仍需进一步研究。虽然我们研究发现临床分期对食管癌中的COX?2的显著表达无明显影响，但Shamma 等［7］对日本食管癌患者研究发现：COX?2在食管鳞状上皮重度异型增生的组织中表达最强，依次强于原位食管癌和浸润性食管癌，这可能与肿瘤基因调控的复杂性以及地区差异等多方面因素有关。关于COX?2与食管癌发生的阶段，仍需进一步探讨，以便明确COX?2抑制剂可否对食管癌前病变起阻断作用。
本实验研究结果表明COX?2在食管癌中表达显著升高， 其在肿瘤的发生、 发展中可能发挥着重要作用， 因此COX?2抑制剂可能通过抑制COX?2的活性来发挥其抗食管癌的作用。 其进一步研究将为肿瘤的化学预防和靶向提供新的策略与途径。
【文献】
［1］ Thun MJ. NSAID use and decreased risk of gastrointestinal cancers[J]. Gastro enterol Clin North Am,1996, 25 (2):333?348.
［２］ Marx J. Anti?inflammatories inhibit cancer growth but how[J].Science, 2001, 291(5504):581?582.
［３］ Dannenberg AJ,Altorki NK,Boyle JO,et al. Cyclooxygenase?2: a pharmacological target for the prevention of cancer[J]. Lancet Oncol,2001, 2(9):544?551.
［4］ Fosslien E. Molecular pathology of cyclooxygenase?2 in neoplasia[J]． Ann Clin Lab Sci, 2000， 30 (1): 3?21.
［5］ Marks F, Furstenberger G. Cancer chemoprevention through interruption of multi?stage carcinogenesis: the lessons learnt by comparing mouse skin carcinogenesis and human large bowel cancer[J].Eur J Cancer, 2000， 36(3)：314?329.
［6］ 庄则毫，王立东，王启鸣,等. 河南食管癌高发区食管癌组织中COX?2的表达［J］.郑州大学学报(医学版),2002, 37 (6):753?755.
［7］ Shamma A, Yamamoto H, Doki Y, et al. Up?regulation of cyclooxygenase?2 in squamous carcinogenesis of the esophagus[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(4):221?229．
