亚砷酸钠对人胃癌细胞株BGC?823的作用机制
作者：赵文韬， 王严庆， 汤为学
【摘要】 目的 探讨亚砷酸钠对人胃癌细胞株BGC?823的作用机制。方法 采用MTT法、光镜、电镜、流式细胞仪检测和免疫细胞化学法研究亚砷酸钠对BGC?823细胞生物学行为的影响。结果 不同浓度的亚砷酸钠均可有效抑制BGC?823细胞生长，且具有浓度和时间依赖性，其中效浓度为4.86μmol/L。流式细胞仪检测发现亚砷酸钠作用不同时间后，细胞均出现G2/M期阻滞。形态学观察显示亚砷酸钠作用72h后，细胞出现典型的凋亡和坏死形态学改变。免疫细胞化学法发现亚砷酸钠能显著上调细胞Caspase?3蛋白的表达。结论 亚砷酸钠对BGC?823细胞的生长有明显的抑制作用，并可诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡和坏死，其机制可能与其抑制ROS的清除，上调Caspase?3蛋白的表达有关。
【关键词】 亚砷酸钠；胃肿瘤；凋亡；Caspase?3
Antitumor Mechanism of Sodium Arsenic on Human Gastric Carcinoma Cell Line BGC?823 in Vitro
Key words：Sodium arsenic；Stomach neoplasms； Apoptosis；Caspase?3
近年来我国学者应用三氧化二砷(As2O3)作为抗肿瘤药物临床急性早幼粒细胞白血病，得到了满意的疗效，表现出完全缓解率高，副作用小、无骨髓抑制等特点[1]。本实验以体外培养的人胃癌细胞株BGC?823为研究对象，观察亚砷酸钠对BGC?823细胞的生物学行为的影响，探讨其作用机制，以期为亚砷酸钠可能的临床应用提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料
人胃癌细胞株BGC?823为低分化腺癌细胞株，由重庆医科大学病理生理教研室提供。亚砷酸钠注射液(10ml:10mg(As2O3)及90mg氯化钠)购于哈尔滨伊达药业有限公司（生产批号：011230）； RPMI1640购自HyClone公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、RNA酶（RNase）、碘化丙啶（PI）购自Sigma公司；鼠抗人Caspase?3单克隆抗体为Santa Cruz公司产品。流式细胞仪（型号：FACScan ）为美国BD公司产品；透射显微镜为日本Hitachi公司产品。
1.2细胞培养
人胃癌细胞株BGC?823用含10%小牛血清的RPMI1640培养液，于37℃，5%CO2培养箱中培养。实验时选用对数生长期细胞。
1.3MTT法检测
将BGC?823细胞密度调整为5.0×104/ml，接种于96孔培养板中，每孔200μl。实验设空白对照组、细胞对照组和实验组。实验组加亚砷酸钠，浓度分别为2.50、5.00、10.00、20.00、40.00μmol/L。空白对照加培养液，不加细胞。每组5个复孔。分别培养24h、48h、72h后，吸去培养液，每孔加入无血清的培养液200μl和MTT（50mg/ml）20μl,继续培养4h后，吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜200μl，用酶标仪测定570mm波长处吸光度（A）值。每组实验重复3次，取均值。参照[2]细胞抑制率。细胞抑制率（％）＝（1-实验组A值/细胞对照组A值）×100％，用直线回归法测定中效浓度IC50值。
1.4细胞周期分析
细胞以5.0×104/ml接种于100ml培养瓶中。加入2.50μmol/L的亚砷酸钠，分别培养24h、48h、72h后收集细胞，PBS洗涤3次，70%冰乙醇固定， PBS洗涤3次，加入20μg/ml的RNase 200μl于37℃水浴30min，加入20μg/ml碘化丙啶（PI）1ml于4℃染色30min。上机用Modifit LT2.0软件分析细胞周期分布。实验重复3次。
1.5细胞形态观察
光镜观察：细胞以5.0×104/ml接种于预置盖玻片的24孔板中，每孔2ml。加入2.50μmol/L的亚砷酸钠，培养72h后， PBS洗涤3次，95%的乙醇室温固定30min后，再用PBS洗涤3次。取出盖玻片，加1ml瑞氏染液染色10min后，光镜下观察。
电镜观察：细胞以5.0×104/ml接种于100ml培养瓶中。加入5.00μmol/L的亚砷酸钠，培养72h后，胰酶消化，收集细胞，PBS洗涤3次，4%戊二醛固定细胞团块2h后，PBS洗涤3次，1%锇酸固定1h，丙酮梯度脱水，618环氧树脂包埋，光镜定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅染色后透射电镜观察。
1.6免疫细胞化学染色
细胞以5.0×104/ml接种于预置盖玻片的24孔板中，每孔2ml。加入5.00μmol/L的亚砷酸钠，培养72h后， PBS洗涤3次，95%的乙醇室温固定30min后，再用PBS洗涤3次。取出盖玻片，常规SP法免疫化学染色，DAB显色，苏木素复染10 min后光镜下观察。结果分析：排除爬片边缘细胞，10×10低倍镜下随机选取10个细胞均匀分布的视野，10×20中倍镜下每个视野随机选50个细胞。按着色强弱分为4个等级：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。按公式HSCORE=∑Pi(i+1)(I = 0，1，2，3；Pi表示评分为i的比例)计算细胞HSCORE得分[3]。
1.7数据分析
采用SPSS10.0统计分析软件处理。采用单因素方差分析，直线回归分析。
2结果
2.1细胞形态观察
光镜下正常对照BGC?823细胞体积大，贴壁形态为不规则的多角形，核大深染，核仁明显。可见巨核细胞和多核细胞。亚砷酸钠作用后，细胞形态结构变得模糊，细胞膜通透性改变，细胞间有着色。部分细胞胞质浓缩，胞核聚集，部分细胞肿胀、碎裂，可见细胞碎片。
亚砷酸钠作用BGC?823细胞后，电镜下可见典型的细胞凋亡和坏死形态学改变。部分细胞坏死表现为细胞肿胀变大、变圆，微绒毛、内质网、线粒体等细胞器肿胀扩张；胞膜、核膜不完整；核溶解、碎裂。部分细胞凋亡表现为细胞皱缩，细胞密度增高，染色质聚集，成新月形，核固缩；细胞边缘胞质突起呈芽泡状，从细胞主体上脱离，有的含有染色质团块，形成典型的凋亡小体，见图1。
2.2免疫细胞化学检测
亚砷酸钠作用后的BGC?823细胞Caspase?3蛋白的表达较对照组细胞明显增加，对照组和亚砷酸钠组细胞Caspase?3蛋白表达的HSCORE得分分别为2.210±0.033、2.794±0.056，差异有显著性（P＜0.01），见图2。
2.3MTT分析
不同浓度的亚砷酸钠作用不同时间对BGC?823细胞的抑制效应，见图3，由图可见亚砷酸钠对BGC?823细胞有明显的抑制作用，且呈浓度和时间依赖性。细胞抑制率随药物浓度的升高和作用时间的延长而提高，差异均有显著性（P＜0.01）。亚砷酸钠作用BGC?823细胞72h 的IC50为4.86μmol/L。表1亚砷酸钠对BGC?823细胞周期分布的影响 注：*、**之间差异有显著性(P＜0.05)。
2.4细胞周期分析
亚砷酸钠作用不同时间后，BGC?823细胞的细胞周期分布，见表1，由表可见亚砷酸钠作用不同时间后细胞均出现G2/M期阻滞，即表现为G2/M期细胞比例逐渐增高，以72h时G2/M期阻滞最明显（P＜0.05）
3讨论
本实验MTT法结果显示不同浓度的亚砷酸钠（2.50～40.00μmol/L）均可有效抑制BGC?823细胞的生长，且呈时间、浓度依赖性。Chen等[4]报道(As2O3)急性早幼粒细胞白血病（APL）患者临床血药浓度为0.5～3.0μmol/L，峰浓度为4.2～6.7μmol/L，亚砷酸钠作用BGC?823细胞72h的IC50为4.86μmol/L，与上述临床浓度相近。推测临床用于治疗APL所使用的浓度，可能对胃癌的治疗有效。
本实验流式细胞仪检测结果显示，亚砷酸钠作用BGC?823细胞后，细胞周期被阻滞于G2/M期。提示亚砷酸钠可通过使细胞阻滞于G2/M期改变细胞周期进程，减少细胞分裂，抑制细胞生长或诱导细胞凋亡。研究表明由于使用的细胞种类或药物浓度不同，As2O3对细胞周期的影响也不完全相同。As2O3可使不同种类细胞阻滞于G1、S或G2/M期。而As2O3是如何参与以细胞周期素（cyclin）?细胞周期依赖性蛋白激酶（CDK）为核心的细胞周期调控机制，阻滞细胞周期进程还有待进一步研究阐明。
近来研究显示砷剂抗肿瘤的机制与其抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的清除有关。很多证据表明ROS的升高可能作为第二信使通过促进线粒体通透性转运孔的开放，上调促凋亡蛋白bax的表达，激活Caspase等作用诱导细胞凋亡。ROS的清除主要依赖于谷胱甘肽还原系统。而砷剂作用的生化基础就在于与谷胱甘肽还原系统化合物的巯基结合，抑制巯基酶的活性，抑制ROS的清除[5]。同一种信号作用于细胞会因信号的强度、细胞的种类不同有不同的反应，或凋亡、或耐受、或坏死[6、7] 。目前大多数研究证明，这种效应的强度和细胞型别依赖性与ROS有关。细胞固有ROS水平不同或产生的ROS的量可不同，不同水平的ROS通过影响Caspase激活、活性及ATP水平决定细胞命运，细胞可出现不同的死亡方式，低的发生凋亡，高的发生坏死[8]。本实验光镜、电镜下形态学观察显示亚砷酸钠不仅能诱导BGC?823细胞凋亡，也能促使BGC?823细胞坏死，提示亚砷酸钠可能通过抑制BGC?823细胞ROS的清除，使ROS含量增加，由于细胞个体异质性， ROS水平不同，细胞出现不同的死亡方式。本实验免疫细胞化学检测显示亚砷酸钠可上调BGC?823细胞Caspase?3蛋白的表达。Caspase?3蛋白是凋亡信号传导途径中外源性和内源性途径的共同的效应Caspase蛋白，是凋亡最重要的执行分子[9]。Caspase?3蛋白表达的增加可能与细胞的凋亡、坏死过程有关，但Caspase?3蛋白表达的上调是否与ROS增加有关，还有待进一步的实验研究。
【】
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