外周血CK?20 mRNA的表达与大肠癌诊断、分期及预后的研究

【关键词】  大肠癌 角蛋白 逆转录?聚合酶链式反应

　　0  引言
   
　　我们利用RT?PCR技术检测了126例大肠癌患者外周血单个核细胞CK?20 mRNA的表达情况, 研究CK?20 mRNA的表达在大肠癌中的临床意义。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象

　　1.1.1  大肠癌组  经手术后病理证实的大肠癌患者126例，男75例，女51例，年龄38～73岁，平均57.4岁；按Duke’s分期：A期23例、B期34例、C期44例、D期25例。术前采集外周血。

　　1.1.2  正常对照组  健康志愿者25例，男17例，女8例，年龄29～58岁，平均46.5岁。

　　1.1.3  细胞株组  ①HT29细胞株（结肠癌细胞株）；②H740细胞株（肝癌细胞株）；③2HTB?133（乳腺癌细胞株）；④TPG5（肺癌细胞株）；⑤K562细胞株（红白细胞病细胞株）；⑥SGC7901（胃癌细胞株），常规细胞培养。

　　1.1.4  其他癌症组  胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌各10例。

　　1.2  方法

　　1.2.1  样品的采集和保存
   
　　（1）血标本的采集  采取大肠癌患者及正常献血员外周静脉血10ml，放入20u/ml肝素处理的防凝试管内，分离出单个核细胞，放入?80℃冰箱保存备测。
   
　　（2）实体瘤标本的来源  大肠癌组织及其他癌症取自大肠癌和其他癌症病人手术后癌组织。标本30min内送实验室，新鲜提取总RNA；不能保证30min内制备的样品，在留取后放?80℃冰箱保存备测。

　　1.2.2  CK?20 mRNA的测定  用RT?PCR法。总RNA的提取：以酸性硫氰酸肌?苯酚?氯仿一步法提出总RNA，?80℃保存待测。逆转录（RT）反应： 于DEPC处理的Eppendorf管中，加入总RNA，MMLV，随机引物，逆转录反应体系，快速离心混匀。37℃1h，95℃10min灭活MMLV。快速离心使蒸气沉于管底。PCR反应： 于0.5ml Eppendorf管中，加入RT反应产物，PCR 反应体系，CK?20上游引物（5’CAGACACACGGTGAACTATGG3’）1μl，CK?20下游引物（5’CAGACACACGGTGAACTATGG3’）1μl，扩增片段长度为370bp；β?actin上游引物（5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’）1μl，β?actin下游引物（5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3’）1μl，扩增片段长度为500bp。95℃ 5min，离心使蒸气沉于管底。加入TaqDNA聚合酶，快速离心混匀。循环条件：94℃ 1min，58℃ 1min， 72℃ 1min。循环35次，末次延长7min。电泳鉴定，观察目的基因，实验中仅出现一条500bp β?actin带，为CK?20 mRNA阴性；同时出现370bp带，为CK?20 mRNA阳性。

　　1.3  随访  对18例Duke’s A患者、23例Duke’s B患者、28例Duke’s C患者进行了随访，内容主要观察远处转移情况。

　　1.4  统计学处理  用POMS2.00版医学统计软件包进行数据处理，用χ2检验。

　　2  结果

　　2.1  CK?20 mRNA的表达情况
   
　　细胞株：仅HT29、SGC7901细胞株阳性，其余细胞株均阴性；25例健康志愿者：外周血CK?20 mRNA均为阴性；126例大肠癌中69例阳性，阳性率54.8%；其他癌症组：仅胃癌组织阳性，其余癌组织均阴性。

　　2.2  Duke’s分期126例大肠癌患者外周血CK?20的表达情况
   
　　各分期CK?20 mRNA表达的阳性率分别为：Duke’s A期21.7%，B期32.4%，C期63.6%，D 期：88%。各分期比较：A期与B期比较χ2=1.948，P<0.05；与C 期比较χ2=2.346，P<0.01；与D期比较χ2=10.605，P<0.01。B期与C期比较χ2=2.806，P<0.01；与D 期比较χ2=7.421，P<0.01； C 期与D期比较χ2=4.343，P<0.01。

　　2.3  随访情况
   
　　Duke’s C期的患者在术前和术后的差异极大，完成随访（12～52月）并且可以评价的患者20例，11例CK?20 mRNA阳性的患者中有6例（54.5%）发生了远处转移，而9例CK?20 mRNA阴性的患者中有3例（33.3%）发生了远处转移，两者比较χ2=1.421，P>0.05，出现这种结果的原因可能是由于Duke’s C期术后的治疗差异极大；Duke’s B期患者术后常规给予 4个周期的“DF方案”化疗，完成随访（12～57月）并且可以评价的患者23例，8例CK?20 mRNA阳性的患者中有5例（62.5%）发生了远处转移，而15例CK?20 mRNA阴性的患者中有3例（20%）发生了远处转移，两者比较χ2=7.803，P<0.05；23例Duke’s A患者中，随访短于的12月的3例，失访2例，完成随访（12～56月）的18例，这18例患者术后在未发生转移前，不进行化疗、放疗、生物治疗和其他治疗），5例CK?20 mRNA阳性的患者中有2例（40%）发生了远处转移，而13例CK?20 mRNA阴性的患者中未发生远处转移，两者比较χ2=10.341，P<0.01。

　　3  讨论
   
　　CK?20是Moll等于1990年首先发现的，CK?20 不同于其他角蛋白成分，它有更严格的特异性上皮分布，主要分布于胃肠道粘膜上皮细胞、泌尿道伞状细胞、表皮Merkel细胞、舌味蕾细胞上。大肠癌是上皮组织来源的肿瘤之一，在其发生过程中癌细胞有可能随时进入血液循环，造成远处转移，而非上皮来源的细胞如正常血细胞上无CK?20分布，如果在大肠癌患者外周血中检测到CK?20 mRNA的表达，则可说明上皮源性肿瘤细胞已经转移入血[1]，有可能形成转移灶。
   
　　从我们的研究结果看，HT29细胞株、SGC7901细胞株CK?20 mRNA表达阳性， 而其它细胞株和献血员外周血细胞CK?20 mRNA表达均阴性。在切除的肿瘤组织中除大肠癌和胃癌CK?20 mRNA表达阳性，其余肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌组织CK?20 mRNA表达均阴性，这说明CK?20 mRNA表达对于诊断大肠癌和胃癌有较高的特异性，这一点在我们以前的相关研究中也得到了证实[2，3]。
   
　　我们观察的 126例大肠癌患者中，随着Duke’s 分期的加重CK?20 mRNA阳性率逐渐升高，且各期之间比较均有显著差异，这说明大肠癌患者外周血CK?20 mRNA阳性表达与Duke’s分期有确切的关系，即随着大肠癌病情的发展和病期的加重外周血微转移率逐渐增加。
   
　　关于Duke’s A期大肠癌是否存在微转移、是否能形成转移灶和是否是一个独立的预后指标一直有争议[4]。我们的研究结果是：Duke’s A期患者CK?20 mRNA阳性率为21.7%，即有21.7%Duke’s A期患者存在血行微转移，这个表明早期大肠癌就可能存在癌细胞的血行转移。从我们对5例CK?20 mRNA阳性Duke’s A期患者随访的结果看有2例最终形成了转移灶，而13例CK?20 mRNA阴性Duke’s A期患者无1例出现转移灶（两组比较有显著性差异），这可以说明如果早期大肠癌患者外周血CK?20 mRNA阳性就有可能最终形成转移灶。根据这个结果如果Duke’s A期大肠癌患者外周血CK?20 mRNA阳性就应该进行相关的治疗。在Duke’s B期外周血CK?20m RNA阳性组的远处转移率为62.5%，而外周血CK?20 mRNA阴性组的远处转移率为33.3%，两组比较有显著性差异，这也进一步证实了大肠癌患者外周血CK?20 mRNA表达情况是一个判断预后的指标。

【】
  　　［1］ Staritz P, Kienle P, Koch M, et al. Detection of disseminated tumour cells as a potential surrogate?marker for monitoring palliative chemotherapy in colorectal cancer patients［J］. J Exp Clin Cancer Res，2004，23(4):633?639.

　　[2] 叶欣，李毅，刘忠民，等. 大肠癌患者淋巴结角蛋白?20mRNA基因表达的临床意义［J］. 中华肿瘤杂志，2002，24（3）：261?264.

　　[3] 王庆才，赵幼安，李毅，等. 胃癌病人外周血细胞角蛋白?20mRNA表达与透明质酸浓度变化的研究［J］. 中华消化杂志， 2001，21（ 9）：565?566.

　　[4] Laso CA, Gonzalez JJ, Fresno F, et al. Prognostic value of micrometastases in esophageal and colorectal carcinoma［J］. Hepatogastroenterology，2004, 51(58): 964?967.