UTI抑制骨肉瘤细胞侵袭与转移的实验研究

               作者：张衣北,陈安民,郭风劲

【摘要】  目的 体外研究尿胰蛋白酶抑制剂（urinary trypsin inhibitor,UTI）抑制人骨肉瘤细胞系MG?63细胞的侵袭与转移。 方法 在体外培养的MG?63细胞培养基中加入不同浓度的UTI，对照组中加入50μl PBS缓冲液，用免疫组化、RT?PCR和Western blot方法检测尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator，UPA)的表达情况。结果 免疫组化染色、RT?PCR及Western blot检测发现随着UTI浓度的逐渐增加，UPA表达量逐渐减少，当UTI浓度增加到100nM时，抑制作用明显（P<0.05），并且呈剂量依赖性。结论 UTI不但从mRNA水平，而且从蛋白质水平抑制骨肉瘤细胞表达UPA，从而抑制骨肉瘤细胞侵袭与转移。

【关键词】  尿胰蛋白酶抑制剂；尿激酶型纤溶酶原激活物；骨肉瘤

    Experimental Study on the Suppression of the Invasion and Metastasis of Osteosarcoma by UTI

     Department of Orthopedics,Tongji Hospital,Tongji  Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,ChinaAbstract：Objective   In order to investigate the effect of invasion and metastasis of human osteosarcoma MG?63 by the urinary trypsin inhibitor(UTI) in vitro.Methods  Different doses（10、50、100、300、500nM） of UTI were added into the human osteosarcoma MG?63 medium and 50μl PBS was added into the control at the same time,then the expression of urokinase type plasminogen activator(UPA) was detected by immunohisto?chemistry,RT?PCR and Western blot.Results  The more concentration of UTI was transfected,the lesser UPA were expressed by the detections of immunohisto?chemistry and RT?PCR and Western blot.When the concentration became 50nM,the suppression was obvious(P<0.05),and the suppression was in dose?dependent manners.Conclusion  The UTI can suppress efficiently the expression of protein UPA both at the mRNA level and at the protein level,then suppress the invasion and metastasis in osteosarcoma cells.

    Key words：Urinary trypsin inhibitor;Urokinase type plasminogen activator;Osteosarcoma

    骨肉瘤是一种恶性度高和破坏性强的肿瘤，常在早期就发生侵袭与转移。在这种复杂且多步骤的侵袭与转移过程中，肿瘤细胞水解细胞外基质是一个非常关键的步骤，有一系列蛋白酶的参与[1]。在这些蛋白酶中，以尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase type plasminogen activator，ＵＰＡ）尤为重要[2]。因此，如何减少肿瘤细胞产生UPA，对抑制肿瘤的侵袭与转移具有十分重要的意义。

    1材料与方法

    1.1主要实验材料与仪器

    人骨肉瘤细胞系MG?63由武汉大学生命院提供；SP试剂盒和AEC显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；RT?PCR试剂盒和Western blot检测试剂盒购自Fermentas公司，DMEM培养基及新生小牛血清购自美国GibcoBRL公司；UPA多克隆抗体和UTI购自Sigma公司。

    1.2  实验方法

    1.2.1细胞培养

    传代后的人骨肉瘤细胞系MG?63接种于含10%新生小牛血清的DMEM培养液中，分别加入不同浓度（10、50、100、300、500nM）的UTI,而空白对照组加入50μl PBS缓冲液。在37℃、5%CO2、95%湿度下培养24h，然后分别收集培养液及细胞检测。

    1.2.2免疫组化染色

    用4％多聚甲醛固定实验组和对照组细胞爬片，然后用SP免疫组织化学染色方法染色（步骤根据说明书进行），并用AEC显色试剂盒显色。胞质或胞核被染成红色为阳性，无着色者视为阴性。封片后照相。

    1.2.3RT?PCR检测UPA mRNA的表达

    提取细胞总RNA，以Oligo(dT)18为引物，用逆转录酶AMV于47℃逆转录为cDNA。以cDNA为模板用PCR检测UPA基因的表达，所用引物为：上游5?GACACGCTTGCTCACC?3,下游3?CACCTACACGGGACTT?5,产物长度为278 bp； 对照β?肌动蛋白(β?actin)所用引物：上游5?ACTGGGACGATATGGAGAA?3，下游3?TCCAGTAGTGATAGCCGTT?5，产物长度为533bp。PCR反应条件：95℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，循环34次,72℃延伸10min。PCR反应结束后取5μl 扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳。

    1.2.4Western blot检测UPA蛋白表达

    收集培养细胞，离心后用预冷PBS缓冲液洗涤，然后加入细胞裂解液，冰浴20min后将细胞裂解成分转至微量离心管，3500r·min-1离心15min，转移上清液至新离心管。Bradford方法测定蛋白质浓度，等量蛋白质（10μg·孔-1）加入6×加样缓冲液，煮沸3min后上样， SDS聚丙烯酰胺凝胶（分离胶8%，积层胶4.5%）垂直电泳分离，电转至PVDF膜上（4℃转膜过夜），室温下含5%脱脂奶粉的TBS?T（10mM Tris·Cl+100 mM NaCl+0.1%Tween20）封闭2 h，加入一抗（1∶1000稀释）4℃作用过夜，1∶1000稀释聚合过氧化物酶标记山羊抗兔IgG室温孵育40min，以BCIP／NBT(武汉博士德)显色系统检测条带，以β?actin为内对照。

    1.2.5图像处理

    免疫组化图像用HPIAS?1000高清晰度彩色病理图像分析系统（华中科技大学同济医学院病理教研室）分析，10×40 光镜下随机选择5 个视野,测其平均吸光度值(A)，扣除背景及阴性值，免疫组化产物染色越深，灰度值越小，抗原物质的含量就越高。

    RT?PCR及Western blot凝胶图像用QuantiScan软件进行条带灰度扫描，每个条带重复5次，取其平均值为条带灰度值，以UPA产物条带与内对照β?actin条带灰度值的比值表示产物相对表达量。

    1.2.6统计学处理

    实验所得数据均以±s 表示,多组间的差异显著性应用统计软件SPSS 11.0进行One Way?ANOVA检验，两组间用t检验， P<0.05为差异有显著意义。

   2结果

    2.1免疫组化观察及图像分析

    用SP法染色和AEC法显色后，MG?63细胞分泌的尿激酶型纤溶酶原激活剂（UPA）蛋白在胞质或胞核中被染成红色，见图1。

    通过HPIAS?1000高清晰度彩色病理图像分析系统分析，随着加入的UTI浓度的增高，各组UPA的A值逐渐增高，当UTI的浓度增加到100nM以上时，与对照组相比，差异有显著性（P<0.05），见表1。表1各组UPA蛋白免疫反应平均吸光度值注：1、2、3、4和5泳道分别为加入500nM、300nM、100nM、50nM和10nM UTI组，6泳道为对照组

    图2UPA RT?PCR后凝胶电泳结果

    为了从蛋白水平检验UTI抑制MG?63细胞分泌UPA蛋白，用Western blot检测显示，对照组UPA蛋白表达量最高，随着UTI浓度的增高，UPA蛋白的表达也逐渐减少,见图3。

    注：1、2、3、4和5泳道分别为加入500nM、300nM、100nM、50nM和10nM UTI组，6泳道为对照组

    图3Western blot检测MG?63细胞中UPA蛋白的表达

    用Quanti Scan软件对RT?PCR及Western blot凝胶图像进行条带灰度扫描后发现，UTI抑制MG?63细胞表达UPA呈剂量依赖方式，当UTI的浓度增加到100nM时，与对照组相比，差异有显著性（P<0.05），这与免疫组化图片分析结果相一致,见表2。表2各组UPA蛋白的相对表达量

　　3讨论

    众所周知，恶性肿瘤的侵袭与转移能力是判断对其成功与否的关键。近年来对恶性肿瘤细胞侵袭与转移的生物学机制进行了大量的研究，现在的观点认为肿瘤细胞发生侵袭和转移与其自身分泌的蛋白酶降解细胞外基质密切相关。在已知的蛋白酶中，UPA具有非常重要的意义，它可能是肿瘤细胞侵袭与转移的“始动”和“调节”因子[3],因此，如何减少UPA的表达生成是当前研究的热门。

    而研究减少UPA生成主要是在研究UPA的合成抑制剂方面，但还没有一种非常有效的抑制剂。尿胰蛋白酶抑制物（UTI）对UPA的抑制作用只在近年来才引起学者们的重视。本研究显示，在骨肉瘤细胞中，当UTI的浓度达到100nM时，能显著减少UPA的表达（P<0.05）,并且随着UTI浓度增加，表达生成的UPA越来越少，呈一种量的依赖性（P<0.05）。在抑制UPA表达方面，UTI是一种非常有效的抑制剂[4]。

    UTI对UPA表达的抑制作用既不是通过影响总蛋白的合成，也不是直接对肿瘤细胞发挥细胞毒作用,很可能是通过某种机制抑制PKC、二酰甘油信使的传递而中断PKC的易位[5]，这样就会导致UPA mRNA 表达的减少。

    目前有报道：UTI能够通过灭活纤维蛋白溶解酶和胰蛋白酶而直接降低细胞相关蛋白酶的活性，从而能够明显减少肿瘤细胞侵袭与转移能力；但是，UTI不能直接抑制UPA的活性[1]。曾有研究表明，在白血病细胞系和人脐静脉内皮细胞用TNF?K处理后，UTI能在蛋白质水平减少UPA的生成。在本实验中，我们发现在UTI浓度较低时（<100nM）,并不能明显减少UPA的生成，只有浓度达到或超过100nM，UTI不仅能在mRNA水平，而且能在蛋白质水平显著减少UPA的生成，并且是一种剂量依赖式。

    Kobayashi等［5］在探讨UTI结构时发现：UTI的氨基端是UTI与肿瘤细胞结合的位点，而其羧基端则是抑制肿瘤侵袭与转移的部位。据此推断UTI影响UPA表达的最可能机制是UTI通过氨基端直接与肿瘤细胞表面蛋白结合，结合后UTI不会向细胞表面扩散，这样在结合处再通过羧基端不仅在细胞表面调节蛋白水解酶的活性，而且能够直接或间接触发细胞内的UPA mRNA 表达调节、蛋白合成和分泌的信号转导，从而有效地抑制肿瘤细胞表达UPA。已经证实UPA表达的减少不但能明显降低肿瘤细胞的侵袭力，而且能抑制肿瘤细胞的活动能力和黏附性[6]。

    综上所述，在体外培养的骨肉瘤MG?63细胞中， UTI不仅能在mRNA水平，而且能在蛋白质水平抑制UPA的表达，因此，有望将UTI开发成新型的抗肿瘤侵袭与转移抑制剂，为肿瘤的治疗提供更全面的方法。

【】
  ［1］ Skogseth H,Larsson E,Halgunset J.Inhibitors of tyrosine kinase inhibit the production of urokinase plasminogen activator in human prostatic cancer cells［J］.2005,113(5):332?339.

[2]蔡强，罗智刚，谭丽等.UPA和VEGF在脑星形细胞瘤侵袭中的作用及其相关性的研究[J].肿瘤防治研究，2004，31（9）：540?541.

[3]Andreasen P A,Kjoller L,Christensen L,et al.The urokinase type plasminogen activator system in cancer metastasis: a review［J］.Int J Cancer,1997,72(1):1?22.

[4]曹正国,周四维,宋晓东,等.UTI 对人膀胱癌T24 细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂表达的影响[J]，2004，31（12）：754?755.

[5]Kobayashi H,Suzuki M,et al.The protease inhibitor bikunin,a novel Anti?Metastatic Agent［J］.Biol Chem,2003,384(5):749?754.

[6]Ohba K,Miyata Y,Kanda S,et al.Expression of urokinase?type lasminogen activator,urokinase?type plasminogen activator receptor and plasminogen activator inhibitors in patients with renal cell carcinoma: correlation with tumor associated macrophage and prognosis［J］.J Urol,2005;174(2):461?465.