LRP及GST?π的表达与非小细胞肺癌的耐药性关系

            作者：姬明丽,千智斌,宋晓荣  

【摘要】  目的 探讨NSCLC的化疗耐药性和参与介导多药耐药的相关基因和蛋白LRP及GST?π的表达，对比分析NSCLC的多药耐药性与上述二种耐药相关基因表达的关系。方法 应用肿瘤细胞体外培养和MTT法对91例未经化疗的NSCLC进行体外化疗药物敏感性测试，观察NSCLC分别对环磷酰胺、阿霉素、顺铂+5?Fu三种单药和联合用药方案耐药情况和总的耐药情况，并用免疫组织化学方法对其进行3种耐药相关基因（LRP、MRP及GST?π）表达的检测,并将其表达情况与对应的化疗耐药性进行相关分析。结果 91例NSCLC化疗敏感性检测结果显示：53例（58.2%）对环磷酰胺耐药，51例（56.0%）对阿霉素耐药，42例（46.2%）对顺铂+5?Fu耐药。其中，19例（20.9%）对三种用药均敏感，27例（29.8%）对三种用药均耐药，其耐药性与组织学类型和分化程度无关（P＞0.05）。LRP和GST?π在91例NSCLC中总的阳性表达率分别为：53.8％和64.8%。鳞癌和腺癌相比LRP和GST?π的表达无显著性差异（P＞0.05）。且LRP和GST?π的表达与对三种化疗用药的耐药性均呈显著正相关 (P<0.05)，并且不同表达程度间也有显著差异性 (P＜0.05)。结论 LRP和GST?π在NSCLC中均有较高的阳性表达并共同介导参与了NSCLC固有多药耐药机制。

【关键词】  NSCLC；多药耐药； LRP基因；谷光甘肽转移酶?π基因；体外药敏试验；免疫组织化学

    The Effection of LRP and GST?π in Mechanism of Drug Resistance of Non?small Cell Lung Cancer

      Key words：Non?small lung cancer;Multidrug resistance;Lung resistance?related protein gene;Glutathione s?transferases?π;In vitro chemosensitivity assay;Immunohistochemisty

    化疗是对失去手术机会及术后复发的非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer,NSCLC）患者的一个重要手段，但由于多药耐药的（multidrug resistance，MDR）产生常导致化疗失败。本实验应用肿瘤细胞体外培养、MTT法和免疫组织化学对91例NSCLC的化疗耐药性与肺耐药蛋白（lung resistance?related protein，LRP）及谷光甘肽转移酶?π(glutathione s?transferases?π,GST?π)的表达关系进行研究，现报道如下。

    1材料与方法

    1.1实验材料

    1.1.1材料收集2001年9月～2002年10月间新乡医学院第一附属、新乡医学院第三附属医院胸外科手术切除的NSCLC新鲜标本91例。所有患者术前均未接受过化、放疗。每例标本分为两份，一部分立即消化后用于药敏试验；另一部分常规10%福尔马林固定、石蜡包埋、连续5μm切片，用于免疫组化染色检查相关耐药基因的表达情况。

    1.1.2主要试剂及培养基小牛血清、RPMI?1640、胶原酶Ⅰ型为Gibco/BRL公司产品；二甲基亚砜、噻唑蓝为Sigma公司产品。

    1.1.3化疗药物及配制

    (1) 化疗药物环磷酰胺（Cyclophamide）、阿霉素（Adriamycin）为北京协和制药厂产品；顺铂（Cisplatin）、5?Fu为旭东海普药业有限公司产品。

    (2) 药物浓度及配制均采用药物在人体内的血浆高峰浓度为药敏测试的药物浓度。

    1.1.4免疫组织化学试剂鼠抗人LRP单克隆抗体（LRP?56）、鼠抗人GST?π单克隆抗体（A3600）、PV6000通用型二步法免疫组化试剂盒、浓缩型DAB试剂盒及免疫组织化学染色常用试剂,均购于北京中山生物技术有限公司。

    1.2实验方法

    1.2.1药敏实验（MTT法）参照[1]进行。药物敏感性判断标准[2]：肿瘤细胞生长抑制率≤30%为耐药，31%～50%为低度敏感，51%～70%为中度敏感，70%为高度敏感。

    1.2.2免疫组织化学染色及判断标准染色方法 按PV6000通用型二步法免疫组化试剂盒说明书进行。结果判断，参照文献[3] 进行。

    1.3统计学处理采用卡方检验、Kruskai?Wallis Test和Spearman Test，均借助SPSS10.0软件完成。

    2结果

    2.1NSCLC的化疗耐药性

    2.1.1总体耐药情况53例（58.2%）对环磷酰胺耐药，51例（56.0%）对阿霉素耐药，42例（46.2%）对顺铂+5?Fu耐药。其中，19例（20.9%）对3种用药均敏感，27例（29.8%）对3种用药均耐药,见表1。表191例NSCLC（鳞癌50例，腺癌41例）对三种用药方式的耐药情况

    2.1.2组织学类型与化疗耐药性的关系不同组织学类型（鳞癌和腺癌）的NSCLC的化疗耐药性无差异（P＞0.05）,见表2。表2NSCLC组织学类型和分化程度与耐药的关系＊鳞癌与腺癌相比；＊＊高分化与中分化相比；＊＊＊低分化与高分化和中分化相比。2.1.3分化程度与化疗耐药性的关系 比较分化程度与化疗耐药性的结果显示：鳞癌：高分化与中分化间无差异（P＞0.05），但二者与低分化相比，低分化鳞癌对所用化疗药物和药物联合明显敏感（P＜0.05）。腺癌：高、中、低分化间均无差异（P＞0.05），但3例低分化腺癌对所用化疗药物和药物联合均敏感，见表2。

    2.2耐药相关基因表达与NSCLC耐药性的关系

    2.2.1LRP在NSCLC的表达与化疗耐药性的关系

    （1）LRP在NSCLC的表达及与化疗耐药性的关系 LRP阳性部位定位于细胞浆，呈棕黄色,见图1、2。91例NSCLC中LRP阴性者42例（包括鳞癌和腺癌，46.2%），阳性者49例（包括鳞癌和腺癌，53.8%）。鳞癌和腺癌相比LRP的表达无显著性差异（P＞0.05），见表3。表3LRP 、GST?π在NSCLC中的表达

    组织学类型LRP表达GST?π表达-+++-+++鳞癌261212171815 腺癌16817151115

    （2）NSCLC中LRP的表达与耐药性的关系LRP的表达在NSCLC的组织学类型（鳞癌和腺癌）间无显著性差异，故对其表达与NSCLC耐药性的关系也未进行组织学类型的分解，结果显示：对于三种化疗用药方案，LRP的表达与NSCLC的耐药性均呈显著的正相关（P＜0.05）；其不同表达程度间也有差异性显著（P＜0.05），见表4。表4LRP、GST?π的表达与NSCLC化疗耐药性的关系

    方案LRP表达GST?π表达-+++-+++环磷酰胺耐药8162971630敏感344025130阿霉素 耐药8152861629敏感345126131顺铂+5?Fu耐药0142801428敏感426132152

    2.2.2GST?π在NSCLC的表达及与化疗耐药性的关系

    （1）GST?π在NSCLC中的表达GST?π阳性部位定位于细胞浆，呈棕黄色，见图3、4。91例NSCLC中GST?π阴性者32例（包括鳞癌和腺癌，35.2%），阳性者59例（包括鳞癌和腺癌，64.8%）。鳞癌和腺癌相比GST?π的表达无显著性差异（P＞0.05），见表3。

    （2）NSCLC中GST?π的表达与耐药性的关系 GST?π的表达在NSCLC的组织学类型（鳞癌和腺癌）间无显著性差异，故对其表达与NSCLC耐药性的关系未进行组织学类型的分解，结果显示：对于三种化疗用药方案，GST?π的表达与NSCLC的耐药性均呈显著正相关（P＜0.05）；其不同表达程度间也有显著性差异（P＜0.05），见表4。

    3讨论

    本研究对91例NSCLC化疗敏感性检测结果显示：53例（58.2%）对环磷酰胺耐药，51例（56.0%）对阿霉素耐药，42例（46.2%）对顺铂+5?Fu耐药。其中，19例（20.9%）对三种用药均敏感，更有27例（29.8%）对三种用药均耐药，说明部分NSCLC有着固有的化疗耐药性。目前NSCLC诱导化疗的总缓解率一般在70%左右[4]，与本研究结果相符。本研究结果还显示：不同组织学类型（鳞癌和腺癌）的NSCLC化疗耐药性无差异（P＞0.05）；比较分化程度与化疗耐药性的结果显示：鳞癌：高分化与中分化间无差异（P＞0.05），但二者与低分化相比，低分化鳞癌对所用化疗药物和药物联合明显敏感（P＜0.05）。腺癌：高、中、低分化间均无差异（P＞0.05），但所有3例低分化腺癌对所用化疗药物和药物联合均敏感，说明低分化者对所用化疗药物和药物联合有较好的敏感性。有研究［5］表明肿瘤在未接触化疗药物前已存在有MDR基因的表达，从本实验的结果来看，有46.2%～58.2%的NSCLC在化疗前已存在着对多种化疗药的耐药性，与此相符。

    作为构成人体穹隆蛋白（major vault protein ，MVP）的主要成分，LRP广泛分布在人体体腔上皮、分泌器官等正常组织中，与P?pg、MRP一样，LRP的主要作用是清除外源性毒性物质，使机体免受损害，其作用机制——阻止以细胞核为靶点的药物通过核孔进入细胞核，并将药物转运到细胞浆的囊泡中，以胞吐的方式排到细胞外[5]。有研究证实LRP参与多种肿瘤对多种化疗药物的耐药[6]，但LRP在NSCLC的表达和与耐药关系的研究较少。本研究发现LRP在NSCLC中阳性表达为53.8%，表明LRP在NSCLC中有着较高而强的阳性表达，提示LRP在NSCLC的固有化疗耐药机制中起着一定的作用。本研究发现91例NSCLC中LRP的表达与对环磷酰胺、顺铂+5?Fu、阿霉素的耐药性均呈显著正相关，并随表达程度的增加而增加（P<0.05），说明在NSCLC中LRP参与了阻止顺铂和5?Fu等对肿瘤细胞DNA的破坏，并且通过胞吐作用对阿霉素影响转录的作用予以限制。故化疗前对NSCLC的LRP表达的检测，对于预测NSCLC对上述药物的耐药有着积极的指导意义。

    GSTs是一多基因家族，目前已发现有α、μ、π、θ和膜结合型5种同工酶，不仅可做为肿瘤转化的标志，而且能催化谷胱甘肽（GSH）与亲电性物质如抗癌药物结合，通过的活性将抗癌药物排出细胞，是肿瘤细胞对抗癌药物的代谢和运输能力增强，从而使肿瘤产生耐药性，而且很多对常规化疗药物耐药的细胞株的GSTs活性较高，GST?π是GST的几种同工酶中表达最高的一种[5]。本研究发现GST?π在 

    NSCLC的阳性表达率为64.8%，也证明GST?在NSCLC中有着高而强的阳性表达，提示GST?π可能是介导NSCLC固有耐药性的主要原因之一。有关NSCLC中GST?π表达与以顺铂为主的诱导化疗疗效分析的研究表明，GST?π高表达患者的生存期明显低于低表达者，且GST?π高表达与p53突变显著相关，说明GST?π通过外排顺铂抑制了由顺铂导致的p53依赖的肿瘤细胞的凋亡。本研究结果也显示GST?л的表达与NSCLC对环磷酰胺、顺铂+5?Fu及阿霉素的化疗耐药性呈显著的正相关并与表达程度有关（P<0.05），说明GST?π是介导NSCLC固有耐药性的重要耐药性因素之一。

    通过本研究，我们发现非小细胞肺癌存在着固有的化疗耐药性，而且LRP及GST?Л的表达与NSCLC的耐药性呈明显的相关性并与表达程度正相关，说明LRP及GST?Л基因共同参与作用了NSCLC的固有的化疗耐药性。

【】
  ［1］ 辛华雯，王润帮.MTT显色法快速测定实体瘤化疗药物敏感性方法［J］.肿瘤防治研究，1993,20（4）：254?256.

［2］ Abe S,Kubota T,Matsuzaki SW,et al.Chemosensitivity test is useful in evaluating the appropriate adjuvant cancer chemotherapy for stage non?scirrhous and scirrhous gastric cancers［J］.Anticancer Res,1999,19(5C):4581?4586．

［3］ 赵彤，朱梅刚，黄宗义，等.肺癌癌基因蛋白产物同步检测的对比分析［J］.癌症，1995,1(3)：13?14．

［4］ Carmichael J,M itche JB,Degraff G.Chemosen sitivity testing of human lung cancer cell lines using the MTT assay［J］.Br J Cancer,1998,57(6):540?544．

［5］ Volm M,Mattern J,Samsel B.Overexpression of P?glycoprotein and gultathion S?transrerase?лin resistant non?small cell lung carcionomas of smokers［J］.Br J Cancer,1991,6(4):700?705．

［6］ 王洁，刘叙仪，蒋薇，等.LRP、MRP、MDR1基因在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义［J］.中华肿瘤杂志，2000,22（4）：304?308．