HIF?1α反义寡核苷酸增强胃癌细胞对顺铂的敏感性

               作者：邓守恒 ,孙各琴,周有利,朱名安,邓守明

【摘要】  目的 研究缺氧诱导因子－1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF?1α）反义寡核苷酸（antisense oligodexynucleotide,ASODN）对人胃癌细胞凋亡及化疗药物敏感性的影响。方法 人工合成HIF?1α ASODN经阳离子脂质体包裹后瞬时转染人胃癌SGC?7901细胞系。采用RT?PCR和免疫细胞化学检测转染后HIF?1α基因表达情况,ＭＴＴ法观察化疗药物敏感性的变化,AO/EB染色及TUNEL检测 SGC?7901细胞转染后顺铂诱导的凋亡。结果 经HIF?1α ASODN处理的SGC?7901细胞HIF?1α基因表达明显下调,HIF?1α ASODN处理的SGC?7901细胞加顺铂作用后与对照组比较,细胞凋亡率明显增加,化疗药物敏感性增强。结论 阳离子脂质体转染HIF?1α ASODN具有促进化疗药物诱导胃癌SGC?7901细胞凋亡及增强化疗药物敏感性作用。

【关键词】  胃癌;反义寡聚核苷酸；缺氧诱导因子－1α;凋亡;顺铂

    HIF?1α Gene Antisense Oligodexynucleotide Enhances the Sensitivity of Gastric Carcinoma Cells to Cisplatin

     Key words：Gastric carcinoma;Antisense oligodexynucleotide;HIF?1α；Apoptosis；Cisplatin

    实体瘤生长迅速造成血供相对减少，局部缺氧极易发生。缺氧导致肿瘤细胞对化疗药物抗拒性增加。HIF?1是调节肿瘤细胞对缺氧等微环境发生适应性反应的主要核转录因子，HIF?1α是决定HIF?1活性的亚单位。HIF?1α在胃癌等多种恶性实体瘤中高表达，与肿瘤的血管形成，侵袭转移，放化疗耐受等恶性行为密切相关，HIF?1α可能是癌症分子中一个极具潜力的靶点［1］。本实验中我们采用阳离子脂质体介导HIF?1α ASODN转染人胃癌细胞系SGC?7901，观察转染后HIF?1α基因表达的变化，检测HIF?1α ASODN转染对顺铂诱导的凋亡及细胞增殖的影响，为反义抑制HIF?1α基因协同化疗治疗胃癌提供实验依据。

    1材料与方法   

   1．1主要材料人胃癌细胞株SGC?7901（中科院上海细胞生物化学研究所）。TUNEL试剂盒、阳离子脂质体Dosper(Roche公司)。SP试剂盒，鼠抗人HIF?1α（福州迈新生物技术公司），细胞培养用1640培养液（Gibco公司），胎牛血清（浙江杭州四季青公司），氯化钴(上海一新试剂公司),RT?PCR试剂盒（Promega）。

    1．2方法

    1．2．1HIF?1α ODN的合成与修饰  HIF?1α ASODN 5‘GCCGGCGCCCTCCAT 3’,并设置了HIF?1α SODN作为对照,5‘ATGGAGGGCGCCGGC?3’。全部碱基进行硫代修饰，其中HIF?1α ASODN 5’FAM荧光标记。     

    1.2.2细胞培养与缺氧模型建立  人胃癌SGC?7901细胞株复苏后,加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。待细胞生长达对数生长期时，换以含终浓度为125μmol/L氯化钴的1640培养液进行化学模拟缺氧实验,置于37℃、5%CO2，饱和湿度的细胞培养箱中继续培养。实验取对数生长期细胞。

    1.2．3实验分组与处理  细胞悬液直接种至6孔培养板内培养，转染时取对数生长期细胞，并融合50%～60%，每种处理有3孔。实验分四组：反义寡核苷酸组（终浓度为5.0μmol/L）、空白对照组、脂质体转染对照组和正义寡核苷酸转染对照组（终浓度为5.0μmol/L）。按照Dosper转染试剂盒说明进行细胞转染。24h后各组均加入顺铂（终浓度10μg/ml）再继续培养24h。中止培养，收集细胞爬片固定备用。

    1.2.4RT?PCR和免疫细胞化学检测HIF?1α基因表达变化  按照1.2.3方法分组，转染后培养24h中止培养。以0.25％胰蛋白酶消化收集各组细胞， 用Trizol提取细胞总RNA，用琼脂糖电泳来确定所提取的RNA是否降解，并以分光光度计测OD值。cDNA的合成按逆转录试剂盒说明书进行。PCR反应条件为：95℃预变性5min,接着95℃,30s; 56℃,45 s; 72℃,60s; 35个循环，最后72℃总延伸10min。HIF?1α的上游引物为：5‘GACAAGCCACCTGAGGAGAG 3’，下游引物为：5‘GTTCGCATCTTGATAAGGCC 3’,381bp。同时选用β?肌动蛋白（β?actin）的mRNA扩增为内参照，其上游引物为：5‘GGCATGGGTCAGA AGGATTCC 3’，下游引物为：5‘ATGTCACGCACGATTTCCCGC 3’,500bp。取10μｌ扩增产物2%凝胶电泳,用NIH ImageJ凝胶图象分析仪分析，所得产物的积分光密度与各自内参照积分光密度的比值来反映该基因mRNA的水平。另取少量消化后收集的细胞制作细胞涂片，经4％多聚甲醛固定15min按照常规免疫细胞化学染色方法检测HIF?1α蛋白表达水平。DAB染色细胞核中出现棕色颗粒者为阳性。采用阳性细胞百分比法，计数不同高倍视野共300个细胞，得出阳性率。

    1．2．5MTT法检测胃癌细胞增殖活性  SGC-7901细胞经消化后计数,以1.5×105个/ｍl接种96孔板,每孔加200μl含10%胎牛血清和氯化钴（终浓度为125μmol/L）的1640培养液,在5%CO2、37℃孵箱中培养24ｈ。培养细胞分组及转染处理同前。转染24h后各组均加入顺铂（终浓度10μg/ml）,再继续培养24ｈ后在培养细胞中加入MTT (5ｇ/L)50μl/孔,孵育4ｈ,加入DMSO100μl/孔,轻摇10min后检测波长490nm的吸光度(A)值，每组3孔。计算各组细胞生长抑制率[抑制率=(空白对照组平均A值-用药组平均A值)/空白对照组平均A值×100%]。

    1.2.6细胞凋亡的检测

    (1) 形态学观察各组细胞转染后24h分别消化离心收集弃上清,加入500μl培养液,配成细胞悬液,再加入实验用AO/EB 溶液20μl,混匀,置1滴于载玻片上,荧光显微镜下观察。

    (2) TUNEL标记法将1.2.3所得各组细胞爬片取出按照TUNEL试剂盒说明书进行染色。结果观察以所见细胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞,每个样品至少计数300个细胞中的阳性细胞数,重复计数3次,取平均值，作为细胞凋亡指数（Apoptotic index,AI）。

    1.3统计学方法

    所有结果均以±s表示,用SPSS12.0进行分析。

    2结果 

    2．1HIF?1α ODN转染联合顺铂对SGC?7901细胞HIF?1α基因表达

    RT-PCR及免疫组化结果显示缺氧时HIF?1α基因在SGC?7901细胞株中高表达。5.0μmol/L HIF?1α ASODN转染联合顺铂作用于SGC?7901细胞24h后，HIF?1α mRNA和蛋白表达明显下调，而空白对照，脂质体对照组和正义对照组HIF?1α基因表达则无明显变化，见图1、2。

    2．2转染HIF?1α ASODN后顺铂对胃癌细胞增殖的影响

    图1HIF?1α ODN转染联合顺铂对SGC?7901细胞

    HIF?1α基因mRNA表达的影响

    M:DNA marker; 1,2,3,4分别为空白对照组，脂质体对照组，正义对照组和反义组

    5.0μmol/L ASODN转染后加入顺铂对胃癌细胞有很强的抑制作用，与各对照组相比均有显著性差异(Ｐ<0.01),而5.0μmol/L SODN组、脂质体组与空白对照组间比较无显著性差异(Ｐ>0.05),见表1。

    2．3转染HIF?1α ASODN对顺铂诱导胃癌细胞凋亡的影响

    在荧光显微镜下见经5.0μmol/ASODN处理后加入顺铂组较多细胞呈现典型的凋亡改变，染色质凝聚成团块状，部分细胞形态变小，形态不规则，并有核碎裂现象。对照组细胞大多形态完整，染色较为均一，偶见少量凋亡细胞。末端标记法可观察到凋亡细胞胞核被染成棕黄色。TUNEL染色显示5.0μmol/L ASODN作用SGC?7901细胞24h再加入顺铂可促进胃癌细胞凋亡，凋亡指数明显高于各对照组（P<0.01），见表1。表1HIF?1α ODN转染＋顺铂对胃癌细胞注：与空白对照组相比较，*P>0.05；与各对照组相比较，△P<0.01

　　3讨论

    Yuen等[2]了大量反义寡核苷酸实验及临床的后提出,化学药物联合某些基因的反义寡核苷酸治疗有可能作为恶性肿瘤的一种有效治疗方法。Zhang等［3］发现HIF?1α ASODN和siRNA能抑制舌鳞癌SCC?4和SCC?9细胞增殖诱导其凋亡。Annika等 ［4］将体外培养的鼠胚胎成纤维细胞（MEF）HIF?1α+/+与HFI?1α-/-分别加入两种临床常用化疗药物（卡铂和依托泊甙）48h后发现HIF?1α-/-组MEF对化疗药物的敏感性及凋亡均显著增加。对肿瘤细胞的研究也有类似发现。

    研究证实HIF?1α基因在人胃癌SGC?7901细胞中表达，缺氧能显著诱导其高表达。本试验结果表明HIF?1α ASODN能下调缺氧时SGC?7901细胞HIF?1α mRNA和蛋白的表达。本实验结果和Dai等[5]报道应用HIF?1α ODN增强顺铂诱导U87细胞凋亡相一致,从而进一步证实转染HIF?1α AsODN可增加顺铂对癌细胞的毒性作用以促使癌细胞凋亡。顺铂化疗具有很大的副反应，而临床实验表明反义核酸几乎无毒副作用，二者联合应用有利于减少顺铂用量，减少不良反应，增强癌细胞对化疗药物的敏感性。本实验通过应用HIF?1α ASODN体外转染胃癌细胞而提高化疗药物对癌细胞的杀伤力,为增强胃癌化疗的敏感性提供了一条新思路。

【文献】
  ［1］ Guppy M.The hypoxic core: a possible answer to the cancer paradox[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,299(4):676?680.

［2］Yuen AR,Sikic BI.Clinical studies of antisense therapy in cancer[J].Front Biosci，2000,5(4):D588?593.

［3］ Zhang Q,Zhang ZF,Rao JY,et al.Treatment with siRNA and antisense oligonucleotides targeted to HIF?1alpha induced apoptosis in human tongue squamous cell carcinomas[J].Int J Cancer,2004,111(6):849?857.

［4］ Annika U,Anke R,Hamid GM,et al.The hypoxia?inducible factor?1 α is a negative factor for tumor therapy[J].Oncogene,2003,22(21):3213?3220.

［5］ Dai S,Huang ML,Hsu CY,et al.Inhibition of hypoxia inducible factor 1 α causes oxygen?independent cytotoxicity and induce p53 independent apoptosis in glioblastoma cells[J].Int J Radiat Onco Biol Phys,2003,55(4):1027?1036.