乳腺癌组织中缺氧诱导因子?1α的表达

             作者：王耕，郝朗松，谭最，易建华，惠震，王明华，孙勤

【摘要】  目的 探讨乳腺癌组织中缺氧诱导因子?1α（hypoxia?inducible factor 1 alpha，HIF?1α）的表达及其与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）及临床病理因素的关系。方法 采用免疫组化SP法检测乳腺纤维腺瘤、普通乳腺增生组织和乳腺癌中HIF?1α、PCNA蛋白的表达。结果 HIF?1α蛋白在乳腺纤维腺瘤、普通乳腺增生组织中不表达；乳腺导管内原位癌中阳性率55%（11/20），浸润性乳腺癌中85%（51/60）；HIF?1α在淋巴结、雌激素受体状态及组织学分级中表达有显著差异。乳腺癌中PCNA阳性率75%（60/80），其中原位癌为65%（13/20），浸润癌为78.3%（47/60）。乳腺癌中HIF?1α表达与PCNA显著正相关（r=0.693，P<0.01）。结论 HIF?1α在乳腺癌组织中明显上调，与肿瘤细胞增殖、淋巴结转移、雌激素受体状态及组织学分级相关，提示HIF?1α对乳腺癌的肿瘤细胞增殖、生长和侵袭转移起重要作用，有望成为肿瘤的新靶点。

【关键词】  乳腺癌；缺氧诱导因子?1α；肿瘤细胞增殖

    Expression of  Hypoxia?inducible Factor?1 Alpha(HIF?1α) in Human Breast Carcinoma 

     Key words：Breast carcinoma; Hypoxia?inducible factor 1 alpha (HIF?1α); Tumor cell proliferation

    缺氧诱导因子?1（hypoxia?inducible factor?1）是缺氧条件下肿瘤细胞产生的一种核转录因子，调节细胞适应低氧状态下的能量代谢和氧的运输，是体内维持细胞内氧平衡的主要调控因子[1]。HIF?1在肿瘤血管生成方面研究较多，而与肿瘤细胞增殖的关系目前国内未见报道。我们采用免疫组化方法检测乳腺纤维腺瘤、普通乳腺增生组织及乳腺癌组织中HIF?1α含量，并分析与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的指数、腋窝淋巴结转移、雌激素受体状态及组织学分级等的关系，旨在探讨HIF?1α在乳腺癌的生长、不同细胞增殖和侵袭转移中的作用。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料

    选取1995年4月～1998年12月郧阳医学院附属太和经病理证实的手术切除标本， 20例乳腺纤维腺瘤， 20例普通乳腺增生组织， 80例乳腺癌。 患者均为女性， 年龄29～72岁， 平均46.5岁， 中位数年龄47岁。 所有患者术前均未接受放化疗。 乳腺癌组织学分类为导管内原位癌20例， 浸润性乳腺癌60例， 浸润性乳腺癌分为高分化30例， 低分化30例； 雌激素受体（ER）阳性48例， 阴性32例； 孕激素受体（PR）阳性43例， 阴性37例； 腋窝淋巴结阳性45例， 阴性35例； 肿瘤直径>2.5cm  45例， <2.5cm 35例。

    1.2  主要试剂

    鼠抗人HIF?1α单克隆抗体购自Neomarker公司，鼠抗人单克隆抗体PCNA、SP试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新公司。

    1.3  实验方法

    标本经10%福尔马林溶液固定，常规脱水包埋，每一例病理标本均作厚度4μm的连续切片3张，分别进行HE染色和免疫组化染色。单克隆抗体HIF?1α的工作浓度1∶40，单克隆抗体PCNA为即用型试剂。HIF?1α、PCNA蛋白表达检测采用SP染色法，参照SP试剂盒说明书进行。PBS代替一抗作阴性对照，用已证实的阳性乳腺癌切片作阳性对照。

    1.4  染色结果判定

    光镜下HIF?1α蛋白以细胞核内有棕黄色颗粒为阳性，由于HIF?1α存在于细胞核中，仅少数胞浆着色的细胞记为阴性。细胞核内出现棕黄色颗粒为PCNA阳性细胞，每例标本高倍镜（×200）下记数1000个细胞核，阳性细胞>25%记为高表达（++），1％～25%记为低表达（+）。

    1.5  统计学方法

    采用SPSS  11.0统计分析软件进行χ2检验、Spearman等级相关分析。

    2  结果

    2.1  HIF?1α蛋白的表达

    HIF?1α阳性反应物为棕黄色颗粒，主要位于肿瘤细胞的胞核中，HIF?1α在乳腺癌及相关组织中的表达，见表1。乳腺纤维腺瘤、普通增生组织中未见HIF?1α的表达；原位癌中阳性率55%（11/20），高分化浸润癌中73.3%（22/30），低分化浸润癌中96.7%（29/30）。肿瘤坏死边缘区域HIF?1α的阳性表达增多，同时我们观察到在62例HIF?1α的阳性病例中有48例有坏死灶，坏死灶周边的细胞着色特别强。偶尔在邻近浸润癌灶的导管增生或非典型增生中发现少数几个HIF?1α着色细胞。χ2检验分析显示HIF?1α的表达在纤维腺瘤（0/20），普通增生组织（0/20），导管原位癌DCIS（11/20），浸润性乳腺癌（51/60）之间有显著差异性（P<0.01）；导管原位癌与高分化浸润癌中无显著差异（P>0.05），低分化浸润癌与导管原位癌之间有显著差异（P<０.01），高分化浸润癌和低分化浸润癌之间有显著差异（P<０.05）。表1  HIF?1α蛋白在乳腺癌及相关组织中的表达

    2.2  PCNA及HIF?1α的表达与临床病理因素、生物学指标之间的关系

    PCNA表达在细胞核，呈明显的小颗粒或粗颗粒状，分布不均匀，浸润癌中明显高于原位癌，乳腺癌总体强阳性表达（++）率为75%（60/80），其中原位癌为65%（13/20），浸润癌为78.3%（47/60）。对照组乳腺纤维腺瘤、普通增生组织中部分导管上皮细胞见弱阳性表达，均为弱表达（+）。HIF?1α与临床病理因素及生物学指标之间的关系，见表2。HIF?1α在年龄、肿瘤大小及孕激素受体状态分组中的表达无显著差异，而在腋窝淋巴结转移、PCNA及ER分组中表达有显著差异。

    2.3  HIF?1α与PCNA的关系

    经Spearman等级相关分析，HIF?1α与PCNA呈显著正性相关（r=0.693， P<0.01）。

    3  讨论

    恶性肿瘤具有缺氧的微环境，肿瘤的形成过程中一个关键的步骤是对缺氧的适应，肿瘤细胞通过提高糖酵解速率和形成多血管体系适应缺氧，从而影响肿瘤细胞增殖和能量代谢。在肿瘤缺氧的微环境中，HIF?1表达增加，活性增强，HIF?1是缺氧条表2  HIF?1α蛋白的表达与乳腺癌临床病理及生物学指标的关系件下存在于人体内的一种异源二聚体，主要由HIF?1α和 HIF?1β两个亚基组成，其中HIF?1α既是氧调节亚基又是活性基。大多数癌及癌前病变中HIF?1α过量产生，正常组织及良性病变中无表达，可和不同缺氧反应基因如血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运蛋白1（Glut1）、促红细胞生成素（EPO）、血红素氧合酶?1（HO?1）及糖酵解酶类等启动子和增强子上的HIF?1结合位点结合，促使这些基因转录，促进肿瘤新血管的生成，维持癌细胞的能量代谢，为癌的进一步生长、肿瘤细胞增殖和转移提供物质基础[2]。肿瘤微环境缺氧是影响HIF?1α活性的一个重要机制，此外，肿瘤密切相关的抑癌基因、癌基因和生长因子与HIF?1α活性密切相关。如抑癌基因VHL在肾透明细胞癌中功能缺失导致HIF?1α高水平表达[3]。HIF?1α需要野生型的p53才能发挥下游靶基因的效应，促进肿瘤血管生成和细胞增殖。

    我们的研究中，乳腺良性肿瘤、普通增生组织中没有发现HIF?1α的表达，但是在大部分导管原位癌（DCIS）和浸润癌中出现了HIF?1α的高表达，且随着组织学分级的增加，HIF?1α表达水平也增加。同时HIF?1α的表达与腋窝淋巴结转移密切相关，腋窝淋巴结转移病例中HIF?1α高表达，这些提示HIF?1α可能作为人类乳腺癌早期浸润阶段的生物学指标，预示一个不良预后。癌旁的导管增生或非典型增生区偶可发现核着色的HIF?1α，癌旁的导管增生（甚至小叶增生）具有形态和基因的改变[4]，应被认为比非癌旁的导管增生更接近癌的病变。非典型增生应被置于普通导管增生和分化较好的DCIS之间的乳腺病变，给予特别关注和临床监控。

    PCNA是细胞核内DNA聚合酶δ的辅助蛋白，直接参与DAN的合成，与细胞增殖状态有关，是评价细胞增殖状态的较客观、准确的指标。PCNA在细胞内含量高时，细胞增殖活跃，倍增时间短，肿瘤细胞分化程度低，恶性程度高，组织侵袭力强，可以作为乳腺癌独立的预后指标[5]。本实验中PCNA分布不均呈异质性，表明细胞的调节失控，增殖迅速，DNA合成紊乱，且阳性率随着组织学分级而增高，HIF?1α与PCNA呈显著正性相关。这些提示HIF?1α和PCNA在乳腺癌中联合检测可能反映肿瘤细胞增殖、生长和侵袭转移的潜能。

    肿瘤细胞缺氧是肿瘤发生恶性转化及转移的启动子，同时肿瘤组织微环境缺氧也是肿瘤效果差，易产生放、化疗耐受性的原因。有研究提示打断低氧诱导基因的转录，在体内和体外均抑制肿瘤生长[6] 。因此通过深入研究HIF?1α在肿瘤中的作用，以HIF?1α为靶点的治疗可能成为肿瘤治疗的又一个重要的方法。

【】
  ［1］ Semenza GL.HIF?1:mediator of physiological and patho?physiological responses to hypoxia[J]. J Appl Physiol, 2000, 88(4): 1474?1480.

[2] Till A, Karl HP. A role for hypoxia and hypoxia and hypoxia?inducible transcription factors in tumors physiology[J]. J Mol Med, 2002, 80(3):562?575.

[3] Bos R, van Diest PJ, van der Groep P, et al. Expression of hypoxia?inducible factor?1α and cell cycle proteins in invasive breast cancer are estrogen receptor related[J]. Breast Cancer Res, 2004, 6(4):450?459.

[4] Mommers EC, Poulin N, Meijer CJ, et al. Malignancy associated changes in breast tissue detected by image cytometry[J]. Anal Cell Pathol, 2000, 20(4):187?195.

[5] Horita K, Yamaguchi A, Hirose K, et al. Prognostic factors affecting disease?free survival rate following surgical resection of primary breast cancer[J]. Eur J Histochem, 2001, 45(1):73?84.

[6] Kung AL,Wang S,Kleo J,et al.Suppression of tumor growth through disruption of hypoxia?inducible transcription[J]. Nat Med, 2000, 6(12):1335?1340.