cyclinD1、CDK4和Rb在大肠癌中的表达及其意义

              作者：陈小贺， 孟文格， 孟繁杰， 谢绍建， 李保东，付泽娴，蔡建辉

【摘要】  目的 探讨细胞周期调控因子在大肠癌中的表达及其与大肠癌临床病理特征的关系。方法 应用免疫组化SP法对70例大肠癌组织及距癌灶3cm以外的癌旁组织、10cm以外的正常组织中cyclinD1、CDK4和Rb进行检测。结果 cyclinD1和CDK4在大肠癌中过度表达，分别为36/70(51.4%)和28/70(40.0%)，并与肿瘤的分化程度呈反比，有淋巴结转移的大肠癌，其cyclinD1和CDK4的阳性率分别为70.0%和60.0%，无淋巴结转移的大肠癌阳性率分别为44.0%和32.0%，两者相比差异有显著性(P<0.05)。Rb在大肠癌、癌旁及正常组织中的表达分别为65.7%、78.6%和85.7%。正常组织与癌组织中Rb的阳性率差异有显著性(P<0.01)。cyclinD1与CDK4呈正相关关系(P<0.05)。结论 cyclinD1、CDK4的过度表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移密切相关；大肠癌的发生机制涉及cyclinD1、CDK4和Rb调节环路中多个基因的异常。

【关键词】  大肠癌；细胞周期素D1；CDK4；Rb蛋白；免疫组织化学

    Expression and Significance of  cyclinD1、CDK4  and Rb in the Colorectal Carcinoma

     Key words：Colorectal carcinoma; cyclinD1; cyclin dependent kinase 4; Rb protein; Immunohistochemistry

    细胞的正常生长依赖于细胞周期中各种调节因子的平衡调控，其中包括细胞周期素D1(cyclinD1)对细胞生长的正性调控及周期素依赖性激酶CDK4抑制子（p16）对细胞生长的负性调控。cyclinD1的过度表达会导致CDK4对视网膜母细胞瘤易感因子（Rb）的调节障碍，使Rb处于持续磷酸化状态，释放大量生长调节因子E2F，细胞过度增殖，诱发肿瘤。我们采用免疫组化法检测70例大肠癌组织，癌旁及正常组织中cyclinD1、CDK4和Rb蛋白的表达，旨在探讨其在大肠癌形成过程中的变化及其与临床病理特征的相互关系，就有可能将其作为肿瘤标志物对大肠癌的预后及肿瘤转移的风险程度作出评价。

    1  资料和方法

    1.1  标本

    收集我院2004年3月～2005年3月间手术切除的大肠癌标本70例。其中男性39例，女性31例。年龄31～75岁，平均年龄54.2岁。结肠癌38例，直肠癌32例。高中分化癌52例，低分化癌18例。有淋巴结转移的20例，无淋巴结转移的50例。Duke's分期：A期＋B期42例，C期＋D期28例。同时取距癌灶3cm以外的癌旁组织、10cm以外的正常组织。所有患者术前均未经放疗和化疗。所有标本经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片，厚度4μm，行HE染色和免疫组织化学染色。

    1.2  HE染色  常规HE染色，光镜下细胞形态学观察，以确定病理诊断及分级。

    1.3  免疫组织化学染色  采用SP法，第一抗体cyclinD1(1∶40)、CDK4(1∶80)和Rb(1∶100)均为Santa Cruz公司产品。SP试剂盒购自北京中山公司。cyclinD1、CDK4和Rb抗体进行微波抗原修复（温度92℃～98℃，持续15min），每批染色均设立阴性和阳性对照，阴性对照（用PBS代替一抗），阳性对照（预实验中表达阳性的切片），免疫组化染色具体步骤按试剂盒说明进行。

    1.4  结果判定  cyclinD1阳性着色定位于细胞核，CDK4阳性着色定位于细胞核和胞浆，Rb阳性着色定位于细胞核，以细胞中相应部位出现棕黄色颗粒为阳性细胞。参照Fromowitz方法，在高倍镜下对细胞内反应如下评分：（1）无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3；（2）阳性范围：<5%为0，5%～25%为1，26%～50%为2，51%～75%为3，>75%为4。两项结果相加<2为阴性（-）,2～3为弱阳性（+），4～5为中度阳性（++），6～7为强阳性（+++）。

    1.5  统计方法  采用SPSS11.5统计软件，两两间比较采用卡方检验，应用非参数统计中Spearman等级相关对cyclinD1、CDK4和Rb在大肠癌中的表达相互间关系进行分析。

    2  结果

    2.1  cyclinD1蛋白在大肠正常组织、癌旁组织及大肠癌组织中的表达，见表1、2

    cyclinD1以细胞核着色为主，见图1。cyclinD1蛋白在大肠癌中阳性表达明显高于正常组织及癌旁组织，与后二者相比差异有显著性， cyclinD1蛋白在大肠癌中高、中分化腺癌与低分化腺癌，有、无淋巴结转移，Duke's分期A/B期与C/D期的阳性表达差异均有显著性。

    2.2  CDK4蛋白在大肠正常组织、癌旁组织及大肠癌组织中的表达，见表1、2

    CDK4在细胞核及细胞浆均有着色，以细胞浆为主，见图2。CDK4蛋白在大肠癌中阳性表达明显高于正常组织及癌旁组织，与后二者相比差异有显著性。CDK4蛋白在大肠癌中高、中分化腺癌与低分化腺癌，有、无淋巴结转移的阳性表达差异均有显著性。

    2.3  Rb蛋白在大肠正常组织、癌旁组织及大肠癌组织中的表达，见表1，2表1  cyclinD1、CDK4和Rb蛋白在大肠正常主要定位于细胞核，见图3。Rb蛋白在大肠癌中阳性表达(65.7%)明显低于正常组织(85.7%)及癌旁组织(78.6%)，与正常组相比差异有显著性(P<0.01)。 Rb蛋白在大肠癌中浸润范围不同的阳性表达差异有显著性(P<0.05)。

    2.4  cyclinD1、CDK4和Rb蛋白在大肠癌表达中的相互关系，见表3

    Spearman等级相关分析表明，在大肠癌组织中cyclinD1与CDK4蛋白两者表达呈正相关关系(等级相关系数r=0.677,P<0.01)；未发现cyclinD1与Rb，CDK4与Rb有明显相关性(P>0.05)。

    3  讨论

    人体细胞的正常生长依赖于细胞周期中各种调节因子的平衡调控，任何一种调控因子发生紊乱将导致细胞异常增殖，从而诱发肿瘤[1]。本组大肠癌cyclinD1阳性率为51.4％。cyclinD1蛋白表达与大肠癌组织学类型、有无淋巴结转移及Duke's分期呈明显相关，而与年龄、性别、癌灶直径大小、癌变部位、浸润范围及是否有远处转移无显著相关性，提示cyclinD1的过表达与大肠癌的进展及转移有关。其表达越强、分化越差、临床分期愈趋向晚期，这就提示cyclinD1可能为今后反映肿瘤生物学行为提供一个有意义的指标。Arber等[2]报道大肠腺瘤中cyclinD1表达随不典型增生分级增加而增高，表明cyclinD1过表达在大肠癌早期形成过程中有可可能起一定的作用。最近LI等[3]研究发现β钙粘连蛋白的异常表达上调了cyclinD1的表达，从而在 表2  cyclinD1、CDK4和Rb蛋白的表达与大肠癌病例临床病理特点间的关系表3  大肠癌组织中cyclinD1、CDK4和Rb蛋白表达的相关性胰腺癌的发生中起重要作用。Andrzej等[4]对48例子宫内膜癌进行cyclinD1、CDK4、p16和Rb免疫组化检测，作者认为Rb通路相关因子异常尤其是cyclinD1、CDK4异常参与了子宫内膜癌的发生发展。CDK4的过表达与患者年龄呈负相关。本文研究结果表明cyclinD1与CDK4呈正相关，cyclinD1与CDK4的过表达大多数发生在较晚期伴有淋巴结转移的大肠癌中，CDK4的阳性强度与细胞的分化程度成反比，推测CDK4活性变化与肿瘤细胞的分化有密切关系。Rb的异常对于某些肿瘤具有预后判断价值[5]。本文研究结果显示Rb的表达与大肠癌的浸润范围有关而与组织学类型、淋巴节转移、远处转移及Duke's分期无关，可能与本组资料较少有关，Rb对于大肠癌预测判断价值有限的原因可能与Rb受多种细胞周期调节因子的调控有关。本文结果为cyclinD1、CDK4和Rb在调节细胞周期活动中构成反馈调节通路的推论提供了依据，表明cyclinD1和CDK4的过度表达通过Rb途径参与大肠癌的发生，大肠癌的分子发生机制中涉及调节通路中多个基因的异常，设法调节抑癌基因Rb和癌基因cyclinD1、CDK4之间的平衡关系，对今后肿瘤的基因有极其重要的价值。

【参考】
  ［1］ Mckay JA, Douglas JJ,Ross VG, et al. Analysis of key cell?cycle checkpoint proteins in colorectal tumours[J]. Pathol,2002,196(4):386?393.

［２］ Arber N, Hibshoosn H, Moss S F, et al. Increased expression of cyclinD1 is an early event in multistage colorectal carcinogenesis[J]. Gastrenterology,1996,110(3):669?674.

［３］ Yu?Jun Li,Zhi?Min Wei,Yun?Xiao Meng, et al.β?catenin up?regulates the expression of cyclinD1,c?myc and MMP?7 in human pancreatic cancer:Relationships with carcinogenesis and metastasis[J]. World J Gastroenterol, 2005,11(14):2117?2123.

［４］ Semczuk A, Miturski R, Skomra D, et al. Expression of the cell?cycle regulatory proteins (pRb, cyclinD1, p16INK4A and cdk4) in human endometrial cancer:correlation with clinicopathological features[J]. Arch Gynecol Obstet, 2004,269(2): 104?110.

［５］ Volm M, Koomagi R, Rittgen W. Clinical implications of Cyclins,Cyclin?dependent kinasis, Rb and E2F?1 in squamous cell lung carcinoma[J]. Int J Cancer, 1998,79(1):294?299.