负载酸洗抗原肽的树突状细胞诱导抗膀胱癌的作用

【摘要】  目的 研究弱酸洗脱法提取抗原肽致敏的树突状细胞(DCs)诱导针对膀胱癌细胞的特异性杀伤效应。方法 弱酸洗脱法获得BIU?87细胞抗原肽，用GM?CSF、IL?4和TNF?α体外诱导正常人DC并负载肿瘤抗原，进而激活T淋巴细胞；用MTT法检测其对BIU?87体外杀伤效应。结果 弱酸可以洗脱肿瘤细胞膜表面大部分与MHC?Ⅰ类分子结合的抗原肽；外周血单个核细胞可培养出DC；效靶比40：1时负载膀胱癌抗原肽的DC诱导特异性CTLs可杀伤高达(78.5±7.0)%的BIU?87细胞 。结论 弱酸可以有效洗脱肿瘤细胞表面的Ⅰ类抗原肽,负载该类多肽的DC在体外可诱导出高效而特异的抗膀胱癌效应。

【关键词】  树突状细胞；膀胱癌；细胞毒性；生物

    Cytotoxicity Induced by Dendritic Cells Pulsed with Acid Eluted Tumor Antigen Peptides against Bladder Cancer Cell Line

    YANG Hui?xiang,XU Yong

    Department of Urology,the Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin Institute of Urological Surgery,Tianjin 300211,ChinaAbstract：Objective   To observe specific cytotoxicity induced by dendritic cells pulsed with acid eluted tumor antigen peptides against bladder cancer cell line.Methods  The antigen peptides of BIU?87 cells were obtained by mild acid eluted technique.DCs were cultured with GM?CSF and IL?4 and TNF?α from healthy human peripheral blood monouclear cells in vitro,then pulsed with bladder?tumor peptides.Tumor specific CTLs were stimulated by DCs pulsed with bladder?tumor peptides and cytotoxicity caused by the CTLs against bladder cancer cells was measured by MTT technique.Results  Mild acid could elute tumor antigen peptides from tumor cells effectively.DCs were induced from peripheral blood monouclear cells.The cytotoxi??city rate of (78.5±7.0)% was noted with DCs stimulated CTLs at effector:target ratio of 40∶1.Conclusion  Mild acid could elute classⅠrestricted peptides from tumor cells.DCs loaded that peptides can induce high performance and remarkably specific cytotoxicity in vitro.

    Key words：Dendritic cell;Bladder cancer; Cytotoxicity; Biological therapy

    树突状细胞（dendritic cells,DCs）是功能强大的抗原提呈细胞，在调节肿瘤免疫应答中起到极其重要的作用［1］。本实验用弱酸洗脱法提取膀胱癌抗原肽，而后用DCs负载抗原肽，研究其在体外诱导的针对膀胱癌细胞的杀伤效应。

    1材料与方法

    1.1细胞株培养

    人膀胱癌移行细胞株BIU?87、人白血病细胞株HL?60均购自典型培养物保藏中心（CCTCC），用含10%FCS的RPMI?1640培养液，在5%CO2、37℃条件下常规培养。

    1.2主要试剂

    人重组粒?巨噬细胞集落刺激因子(rhGM?CSF)、人重组白细胞介素?4(rhIL?4)和人重组肿瘤坏死因子?α(rhTNF?α)为PeproTech EC公司产品，藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人HLA?DR、CD1a、CD83、CD86、CD80及同型对照IgG1为Immunotech产品；PE标记的鼠抗人HLA?ABC（W6/32）及同型对照IgG2为eBioscience产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；Bradford蛋白浓度测定试剂盒为TPI公司产品。

    1.3弱酸洗脱法获取抗原肽

    取对数生长期的BIU?87细胞10ml(浓度2×105个/ml)，离心后弃上清，加入4ml弱酸提取液(0.131mol/L枸橼酸，0.066mol/L磷酸氢二钠，调节pH至3.3) ，室温下轻晃5min，离心吸取上清液，置于-20℃冰箱短期保存。流式细胞仪检测弱酸洗前后BIU?87细胞表面表达HLA?ABC（W6/32）的情况。共收集1×107细胞的弱酸洗脱液，透析后置入超滤离心管（4ml，5kD，Amicon公司产品）浓缩液体。加入PBS液定容至1ml，过滤，分装。按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书所示方法，测得Ａ595，并据标准曲线抗原蛋白浓度，-80℃保存备用。

    1.4肿瘤抗原肽致敏DCs的培养与鉴定

    取肝素抗凝健康人新鲜O型外周血100ml，密度梯度法制成单个核细胞（PBMCs）悬液。调整细胞浓度为2×106/ml，培养 2h后获得的贴壁细胞分为实验组和对照组，其中实验组加入rh GM?CSF 800U/ml、rhIL?4 1 000U/ml、rhTNF?α 100ng/ml。每3天半量更换新鲜培养基和细胞因子，对照组只补充新鲜培养基。将培养第3、6d的DCs分别加入肿瘤抗原肽10mg/L或不加入。第9d收集细胞。流式细胞仪检测细胞表型；自体混合淋巴细胞反应检测DCs对T淋巴细胞的促增殖能力。

    1.5细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的培养

    尼龙毛柱法获取自身新鲜T淋巴细胞。调整细胞浓度为1.2×105/ml，将其分为4组：第1组加入经酸洗脱的膀胱癌细胞抗原肽致敏的DCs，第2组加入未负载抗原的DCs，第3组加入肿瘤抗原10μg，第4组加入对照的单个核细胞，共同孵育4d（效应细胞与刺激细胞比例为20∶1）后进行杀伤活性的测定。

    1.6细胞毒实验

    调整丝裂霉素C处理的BIU?87细胞和HL?60细胞浓度为1×104／ml，分别加入96孔板，各分为5组：A组加入经酸洗脱的膀胱癌细胞抗原肽致敏的DCs激活的CTLs，B组加入未负载抗原DCs激活的CTLs，C组加入膀胱癌抗原肽致敏的T细胞，D组加入单个核细胞刺激的T细胞，E组加入未致敏T细胞。以上组均按照效靶比10:1、20:1、40:1的比例加入效应细胞。同时设立对照。培养48h后用MTT法测量CTLs细胞毒活性，测定各孔A值。根据公式计算杀伤率：杀伤率 =[靶细胞A值-(细胞杀伤反应后A值-效应细胞A值 )]/ 靶细胞A值×100％。

    1.7统计学处理

    各组实验数据均以±s表示，采用SPSS 10.0统计软件作方差分析。

    2结果

    2.1弱酸洗脱法获取肿瘤抗原多肽的分析

    在pH3.3时，弱酸缓冲液具有极好的洗脱作用，室温下可以洗脱绝大部分BIU?87细胞膜表面与MHC?Ⅰ类分子相结合的抗原肽，见图1。弱酸洗脱1×107个BIU?87细胞可获得(426.0±4.3)μｇ抗原肽。

    A.弱酸洗脱前            B.弱酸洗脱后

    图1弱酸洗脱前后BIU?87细胞膜表面

    MHC?Ⅰ类分子细胞表型分析

    2.2DC的鉴定

    从PBMCs中获得的贴壁细胞，经9d培养后，细胞具有典型的分叶型细胞核和长的胞浆突起,见表1。与单核细胞比较，树突状细胞表达DCs特征性标志CD1a、CD83，差异有显著性（P<0.05）；DCs是否负载抗原，对其细胞表型无影响 (P>0.05）。不同类型DCs刺激自体T细胞的增殖能力情况，见图2，与单核细胞比较，树突状细胞对自体T淋巴细胞有更高的刺激指数 (P<0.05）。表1外周血单核细胞培养9d后细胞表型分析

    2.3CTLs细胞毒活性的测定

    各组不同刺激物诱导的CTLs细胞毒性结果见表2。与其他各组比较，负载抗原DCs的CTLs组对BIU?87的杀伤率差异有明显显著性（P<0.01），而对无关肿瘤HL?60的杀伤率差异无显著性(P> 表2各组不同刺激物诱导的CTLs对BIU?87和  HL?60的杀伤率注：A 负载抗原肽的DC激活的CTLs；B 未负载抗原的DC激活的CTLs；C 膀胱癌抗原肽致敏的T细胞；D 单核细胞刺激的T细胞；E 未致敏的T细胞与相应浓度的未致敏的T细胞相比，＊P<0.05，**P<0.010.05)。随效靶比的增加，其杀伤靶细胞的作用增强（P<0.05）。

    3讨论

    细胞免疫在抑制肿瘤发生过程中起着关键性作用，但由于肿瘤患者的CTLs不能识别肿瘤细胞导致其无法发挥细胞毒作用。DCs是目前发现的功能最强大的专职抗原提呈细胞，具有启动T细胞免疫的所有必需特性，在肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用[2]。

    在肿瘤免疫中，T淋巴细胞识别的是存在于肿瘤细胞或抗原提呈细胞表面的结合在MHC?Ⅰ类分子多肽结合沟内的抗原多肽。如果提取这种抗原多肽来诱导CTLs，就可以实现对肿瘤的特异性免疫。目前发现，弱酸洗脱法可以特异洗脱细胞膜表面与MHC?Ⅰ类分子相结合的抗原肽，而对与MHC－Ⅱ和其他非MHC结合的抗原无影响，也不会引起多肽结构改变，使酸洗物成分相对单一[3]。鉴于目前对人类膀胱癌特异性抗原远远没有搞清楚，故我们采取流式细胞术检测弱酸洗脱前后细胞表面HLA?ABC( MHC?Ⅰ)分子的表达情况。实验结果表明，BIU?87细胞经弱酸洗涤后，其表面的W6/32表达量明显减少，亦既MHC?Ⅰ类分子及与之结合的多肽被洗脱下来，从而证明洗脱液主要成分为膀胱癌抗原肽。

    以弱酸洗脱BIU－87细胞的方法获取的肿瘤抗原肽能够保留其抗原性和特异性。本实验表明，其对BIU?87的杀伤率可高达(78.5±7.0)%,显著高于单核细胞和T细胞的作用，而单纯DCs致敏的CTLs对BIU?87只有较弱的杀伤作用；同时，与单核细胞比较，两种DCs对无关细胞系HL?60的杀伤效果无差异，提示DCs可有效地捕获、提呈膀胱癌抗原并诱导出膀胱癌特异性CTLs，产生高效抗膀胱癌效应，这对临床膀胱癌疫苗的应用提供了新的选择。

【】
  ［1］ Adams S,O’neill D,Bhardwaj N,et al.Recent advances in dendritic cell biology [J].J Clin Immunol,2005,25(2):87?98.

[2]Bottomly K.T Cells and Dendritic Cells Get Intimate[J].Science,1999,283(5405):1124?1125.

[3]Runnels HA,Moore J,Jensen P,et al.A structural transition in class II major histocompatibility complex proteins at mildly acidic pH [J].J EXP Med,1996,183(1):127?136.