利用siRNA抑制人骨肉瘤细胞survivin的表达
作者：李鲲，杨述华，刘红云，傅德皓，宁旭，梅荣成
【摘要】 目的 构建生存素（survivin）短发夹状RNA表达载体，检测其对骨肉瘤细胞survivin mRNA及蛋白表达的影响。方法 体外构建survivin shRNA 表达载体pSilence2.1?neo?survivin,转染骨肉瘤细胞系MG?63，RT?PCR、免疫组化方法检测转染前后survivin mRNA及蛋白的表达，MTT比色法检测细胞增殖活性。结果 pSilence2.1?neo ?survivin载体转染能显著抑制survivin mRNA、蛋白表达，转染后48h细胞增殖的抑制率为61.83%。结论 pSilence2.1?neo?survivin可显著抑制MG?63细胞survivin mRNA、蛋白的表达及细胞的增殖活性。
【关键词】 survivin；RNA干扰；短发夹RNA；骨肉瘤
Inhibition of the Expression of survivin in Osteosarcoma Cell by A Short Hairpin RNA
Key words：survivin；RNA interference；Short hairpin RNA；Osteosarcoma
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是一种新兴的转录后基因阻断技术, 可以简单、有效、特异地下调细胞中目的基因的表达。我们以survivin为靶点，体外构建短发夹状RNA的表达载体, 观察其对MG?63细胞survivin基因表达的影响，为骨肉瘤基因的进一步研究提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
人骨肉瘤细胞系MG?63为本教研室保存，Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品，pSilence2.1?neo为Ambin公司产品， RT?PCR试剂盒为MBI公司产品，鼠抗人survivin单克隆抗体及SP试剂盒为Santa Cruz公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 pSilence2.1?neo?survivin表达载体构建及细胞转染 参照Harborth等［1］的干涉RNA 设计原则，以人survivin的mRNA序列5′?TTCGTCCGGTTGCGCTTTC? 3′为靶点，体外合成两端带有BamHⅠ和HindⅢ粘端酶切位点、内含5?TTCGTCCGGTTGCGCTTTC?TTCAAGAGA?GAAAGCGCAACCGGACGAA?3发夹状序列的双链DNA，将合成的片段接入pSilence2.1?neo载体，筛选、扩增后经测序证实构建成功。分4组进行细胞转染处理：空白组、脂质体组、空载体组、shRNA组。
1.2.2 RT?PCR检测细胞survivin mRNA的表达 分别收集转染24、48、72h细胞, 提取细胞总RNA，并进行逆转反应。引物的序列为： survivin：上游：5′?ATGGGTGCCCCGACGTTG?3′下游：5′?AGAGGCCTCAATCCATGG?3′，扩增产物436bp。β?actin：上游：5′?TGGCATTGCCGACAGGATGCAGAA?3′下游：5′?CTCGTCATACTCCTGCTTGCTGAT?3′，扩增产物172bp。以survivin与β?actin条带的积分吸光度（IA）比值表示survivin mRNA的相对含量。
1.2.3 免疫组化法检测survivin蛋白的表达 按上法处理细胞24、48、72h后，SP法进行免疫组化染色。以细胞浆和/或核呈现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，并阳性表达率：阳性表达率=（每500个细胞中阳性细胞数/500）×100%。
1.2.4 MTT法检测细胞增殖活性 按上法处理细胞24、48、72、96h后，行MTT染色，测OD值，计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=（空白组OD值?处理组OD值）/空白组OD值×100%。
1.3 统计学处理
采用SPSS10.0统计软件，对数据进行t检验。
2 结果
2.1 RT?PCR结果
shRNA组436 bp处的条带亮度显著低于其余各组，见图1，与空白组相比shRNA组24、48、72h mRNA 表达抑制率分别为68.52%、74.87%和71.93%， 其抑制作用在24～48h逐步增加，48～72h有所减低，余各组之间无明显差别，见表1。表1 survivin shRNA对MG?63细胞survivin mRNA表达的影响
2.2 免疫组化结果
空白组、脂质体组、空载体组多数细胞中均出现明显的棕黄色的颗粒状细胞浆和/或核着色，见图2，而shRNA组细胞着色较淡，阳性细胞数目较少，见图3。 统计结果显示，shRNA组survivin蛋白表达明显低于其他组，见表2。表2 survivin shRNA对MG?63细胞 survivin蛋白表达的影响
2.3 MTT比色法比较细胞增殖活性
与空白组相比，载体转染后24、48、72、96h细胞的增殖活性均受到了显著抑制，48h抑制率最高，为61.83%。其他组间细胞的增殖情况的差异无统计学意义，见表3。
3 讨论
RNAi是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA（double－stranded RNA, dsRNA）引起同源mRNA 特异性的降解，从而高度特异性、高效性地抑制目的基因表达的技术。利用siRNA 干涉技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持在静寂或休眠状态，可表3 MTT法检测shRNA对MG?63人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用达到抗肿瘤作用。Lin等［2］利用RNAi 技术使bcl?2 基因静寂，从而抑制了前列腺癌LNCaP 细胞的生长，并可见到染色体浓缩、基因组DNA 断裂等细胞凋亡的特征性变化；Elbashir等［3］将体外合成的特异性siRNA转染入人宫颈癌Hela细胞， 结果发现其靶向mRNA 所表达的蛋白质的量比转染前降低了90%。
survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子，属于凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族的新成员。survivin表达于胚胎和发育的胎儿组织，在终末分化的成人组织中不表达（胸腺除外），但在人类大多数的恶性肿瘤组织中高表达且与肿瘤的恶性程度及预后密切相关［4，5］。其通过抑制凋亡通路末端的效应子caspase?3和caspase?7而阻断各种刺激（如Fas、caspase、bax、化疗药物）诱导的肿瘤细胞凋亡过程［6］。 采用反义技术阻断肿瘤细胞survivin基因的表达可抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、增强化疗或放疗的敏感性，故此survivin基因已成为当前肿瘤基因研究的热点。
本研究设计并构建了针对 survivin 的shRNA表达载体pSilence2.1?neo?survivin，并证实该载体转染可以显著抑制 MG?63细胞中survivin mRNA及蛋白的表达并显著抑制MG?63细胞的增殖活性，为靶向survivin基因进行骨肉瘤基因治疗的进一步研究提供了实验基础。
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［1］ Harborth J，Elbashir SM， Bechert K，et al. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs［J］. J Cell Sci，2001, 114(Pt 24): 4557?4565.
［2］ Lin SL, Chuong CM,Ying SY.A novel mRNA－cDNA interference phenomenon for silencing bcl?2 expression in human LNCaP cells［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 281(3)：639?644.
［3］ Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21 ?nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］. Nature, 2001, 411(6836): 494?498.
［4］ Altieri DC. The molecular basis and potential role of survivin in cancer diagnosis and therapy［J］. Trends Mol Med，2001, 7(12): 542?547.
［5］ Trieb K, Lehner R, Stulnig T, et al. survivin expression in human ost?eosarcoma is a marker for survival［J］. Eur J Surg Oncol，2003,29(4): 379?382.
［6］ Shin S, Sung BJ, Cho Y，et al. An anti?apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase?3 and ?7［J］. Biochemistry，2001, 40(4): 1117?1123.
