bcl?2家族BH3?only蛋白在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用

           作者：谢奇朋，叶 艳，郝延璋，张旭东，张林杰

【摘要】  目的 研究bcl?2家族BH3?only蛋白Noxa、Bim和PUMA在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用。方法 Annexin V?FITC染色，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率，半定量RT?PCR检测细胞中BH3?only蛋白的mRNA表达量。结果 依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡具有剂量、时间依赖性，SGC?7901细胞系比BGC?823更加敏感，100μM的依托泊苷作用48小时后SGC?7901的凋亡率达到50%，而BGC?823的凋亡率只有20%。BH3?only蛋白Noxa的mRNA表达明显上调，Bim少量上调与依托泊苷诱导的细胞凋亡有关系；相反，PUMA的mRNA表达量在依托泊苷前后没有变化。结论 依托泊苷诱导的胃腺癌细胞凋亡与BH3?only蛋白Noxa和Bim表达上调有关联。

【关键词】  Noxa；Bim；PUMA；胃腺癌；细胞凋亡；依托泊苷

    Key words：Noxa；Bim；PUMA；Gastric adenocarcinoma；Apoptosis；Etoposide

    胃癌是常见的恶性肿瘤之一。化疗药物依托泊苷（又名VP?16、鬼臼乙叉甙）为细胞周期特异性抗肿瘤药物，依托泊苷可以与DNA拓扑异构酶II相互作用形成药物?酶?DNA稳定的可逆性复合物，阻碍DNA修复，从而诱导细胞凋亡。BH3?only蛋白是近年来研究比较热门的一类bcl?2家族中具有凋亡启动作用的亚家族,包括Bim（bcl?2 interacting mediator of cell death），Noxa（PMAIP1），Puma（p53 upregulated modulator of apoptosis），Bad，Bmf等，通过与bcl?2/bax相互作用启动“内源性”凋亡途径，导致细胞凋亡。Noxa和PUMA主要受p53调节，细胞DNA损伤后通过p53可以上调Noxa和PUMA的表达［1］； Bim主要结合在微管动力蛋白上，受到细胞因子去除、Ca2+流出、紫外线照射、微管动摇和紫杉醇等刺激后可以转移到线粒体膜上［2］，从而发挥促凋亡活性。本研究使用依托泊苷作用胃腺癌细胞，检测BH3?only蛋白的表达与细胞凋亡之间的关系，研究依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡的分子机制。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    依托泊苷购自沈阳科瑞斯德医药科技有限公司；SGC?7901和BGC?823胃腺癌细胞购自上海生命院细胞库，Annexin V 为caltag公司产品；TRIzol为Invitrogen公司产品；逆转录试剂盒为Promega公司产品；引物由上海生工生物工程公司合成。

    1.2  主要实验仪器

    流式细胞仪型号为FACScalibur；PCR仪为MJ RESEARCH .INC公司的PTC?100；凝胶成像系统为黑马公司产品；电泳仪为北京六一仪器厂产品。

    1.3  细胞培养及药物配制

    SGC?7901和BGC?823细胞接种于含有10%小牛血清（FCS）、1%双抗、1%L?谷胺酰胺的DEME培养液中，在37℃，CO2浓度为5%的培养箱中生长，每2～3d传代一次。依托泊苷用DMEM培养液配制成10 000μM贮存液，在－20℃中保存，临用前稀释成所需浓度。

    1.4  流式细胞术

    用酶消化法收集不同浓度依托泊苷诱导各个时点的细胞，冰冷PBS洗涤两遍，binding buffer重悬细胞，调整细胞密度为5×105/ml，取195μl细胞悬液加5μl Annexin V混匀避光作用30min。流式细胞仪在488nm激发波长处进行检测，实验重复3次，取平均值，结果用WINMDI2.8软件分析。

    1.5  RNA提取及质量鉴定

    按TRIzol说明提取细胞总RNA，紫外分光光度计鉴定样品的纯度和浓度。测得的A260/A280均在1.8～2.0之间，RNA电泳可见清晰的28S、18S和5S三条带，RNA用PCR扩增GAPDH无产物，表明所提取的RNA中没有DNA污染。

    1.6  半定量RT?PCR

    逆转录按照Promega逆转录试剂盒说明操作，各个标本调整到同一浓度再进行逆转录。内参照为GAPDH，引物：GAPDH（580bp）上游：AATCCCATCACCA TCTTCCA，下游：CCTGCTTCACCACCTTCTTG，Noxa（196），上游：AGATGC CTGGGAAGAAG，下游：AGTCCCCTCATGCAAGT，Bim（204bp），上游：GCCCCT ACCTCCCTACAGAC，下游：ATGGTGGTGGCCATACAAAT，Puma（212bp），上游：GCCCAGACTGTGAATCCTGT，下游：TCCTCCCTCTTCCGAGATTT，PCR的反应程序为：94℃ 5min后进入循环，每循环为94℃ 30s，55℃ 30s 72℃ 30s，32个循环，最后是72℃延伸7min ，内参照GAPDH的引物在第8个循环后加入，扩增24个循环。取8μl PCR反应产物，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，80V，1h，在黑马凝胶成像系统拍照。以GAPDH的表达强度为对照观察Noxa、Bim和Puma的相对表达强度。

    2  结果

    2.1  依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡

    我们用50μM、100μM、250μM和400μM四个浓度的依托泊苷作用SGC?7901细胞48h，然后用FITC?Annexin V染色流式细胞仪检测凋亡细胞。结果显示随着依托泊苷浓度的增加，细胞的凋亡率不断增加，见图1a，半数抑制浓度IC50为100μM。然后我们用100μM的依托泊苷作用SGC?7901细胞8h、16h、24h、36h和48h，流式细胞仪检测细胞的凋亡率，见图1b，结果显示依托泊苷作用8h即有细胞发生凋亡，随着时间的增加，凋亡也不断增加，48h达到50%，由此我们可以得出依托泊苷诱导SGC?7901胃腺癌细胞凋亡具有剂量和时间依赖性。然后我们用100μM的依托泊苷作用BGC?823胃腺癌细胞48h，流式细胞仪检测凋亡率为20%，与SGC?7901的结果比较，我们得出SGC?7901为依托泊苷敏感细胞株，而BGC?823为不敏感细胞株。 流式细胞仪检测细胞凋亡结果见图2。

    2.2  依托泊苷能上调敏感细胞株SGC?7901中Noxa mRNA表达

    在SGC?7901和BGC?823细胞株中Bim的mRNA表达都上调。

    将100μM的依托泊苷分别作用SGC?7901和BGC?823胃腺癌细胞0h、4h、8h、16h和24h，然后检测Noxa、Bim和PUMA的mRNA表达水平。结果显示在SGC?7901细胞中，Noxa的mRNA表达早在4h即开始明显增加，8h达到高峰，见图3a。在BGC?823细胞中，Noxa的mRNA表达无明显变化，见图3b。Bim的mRNA在两个细胞系中均表达上调，不过开始升高的时间靠后，在SGC?7901中8h开始升高，见图3c，在BGC?823中16h开始升高，见图3d，而且升高的幅度没有Noxa的mRNA大。两个细胞系在依托泊苷诱导后PUMA的mRNA表达没有变化（结果尚未发表）。

    3  讨论

    化疗药物主要通过诱导细胞发生线粒体途径即内源性细胞凋亡来起作用，bcl?2家族在线粒体途径凋亡中起重要作用。bcl?2家族包括bcl?2［3］、bax［4］和BH3?only三个亚家族［5］，bcl?2亚家族含有4个BH域抑制凋亡发生，bax亚家族含有多个BH域，促进凋亡，而BH3?only亚家族只含有一个BH3域，包括Noxa、Puma、Bim等，正常细胞中，bcl?2亚家族和bax亚家族处于平衡状态不发生凋亡，BH3?only蛋白的BH3域是两性螺旋，其亲水面能与bcl?2亚家族BH1、BH2、BH3形成的亲水槽结合，置换出bax亚家族从而发挥促凋亡作用。bax亚家族寡聚化插入线粒体，使PT孔开放，线粒体外膜通透性增加而使线粒体内的细胞色素C和Smac/DIABLO释放入胞浆，细胞色素C与Apaf?1、dATP组成凋亡体，激活caspase级联反应，最后由caspase?3裂解细胞中关键蛋白而使细胞发生凋亡。

    Noxa和PUMA的表达主要受p53调节。当细胞DNA损伤时， p53被激活，通过诱导p21WAF1使细胞周期停滞，以便对DNA损伤进行修复［6］；如果损伤严重无法修复时，p53通过做为转录因子激活Noxa、Puma等来诱导细胞凋亡。何种下游基因被激活取决于细胞类型和细胞状态，例如在宫颈癌细胞、造血干细胞［7］、神经母细胞瘤［8］中通过Noxa，在结肠癌细胞中则通过PUMA来诱导凋亡［9］。Bim在人类乳腺癌、前列腺癌以及非小细胞性肺癌细胞系中均有表达，并且在一定刺激下Bim的表达上调能引起肿瘤细胞凋亡［10?12］。

    本课题着重研究在胃腺癌细胞凋亡中BH3?only蛋白的作用，依托泊苷为DNA损伤化疗药物，主要通过p53途径诱导细胞凋亡，我们结果表明依托泊苷作用后SGC?7901细胞发生明显的凋亡，48h凋亡率达到50%，Noxa的mRNA表达明显增高，但是PUMA没有变化，表明在SGC?7901胃腺癌细胞中p53主要通过Noxa而不是PUMA来诱导细胞凋亡。BGC?823细胞对依托泊苷不是很敏感，48h凋亡率只有20%，而且Noxa和PUMA的mRNA表达均没有变化。BGC?823是低分化胃腺癌细胞，可能p53发生突变所以不能诱导下游基因的表达，报导在50%以上的肿瘤中都发现有p53的缺失或者突变［13］。或者依托泊苷诱导BGC?823细胞的凋亡不通过p53途径，还存在其他途径。

    在两个细胞系中均有Bim的mRNA表达增高，这表明DNA损伤也可以通过Bim途径来诱导凋亡，但是Bim的mRNA开始升高的时间比较迟，且幅度比Noxa小，说明在依托泊苷诱导SGC?7901细胞凋亡中Noxa起主要作用，而Bim起次要作用。BGC?823细胞虽然对依托泊苷不敏感，但还是有20%的凋亡率，可能是通过Bim来诱导细胞凋亡的。

    总之，我们的研究发现依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡与BH3?only蛋白Noxa和Bim表达上调有关联，这为胃肿瘤带来新的治疗靶点。Noxa和Bim在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的确切作用还有待于用siRNA技术进一步研究。

【文献】
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［2］Puthalakath H, Huang DC, O’Reilly LA, et al. The proapoptotic activity of the Bcl?2 family member Bim is regulated by interaction with the Dynein Motor complex［J］. Mol Cell, 1999, 3(3): 287?296.

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