顺铂诱导卵巢癌耐药细胞系A2780/DDP凋亡的时间和剂量依从性

来源:岁月联盟 作者: 时间:2010-07-12

              作者:符淳,李光仪, 刘晓英 ,林秋华, 刘风英, 谢咏

【摘要】  目的 探讨不同浓度顺铂作用不同时间诱导敏感和耐药卵巢癌细胞系发生凋亡变化和凋亡途径相关蛋白的表达。方法 选择卵巢癌顺铂耐药细胞系 A2780/DDP和敏感细胞系A2780为研究对象。在细胞培养基础上,运用MTT比色法、原位标记法、常规免疫组化和蛋白印迹等方法,观察不同剂量的顺铂(5、10、20、40μmol/L)和作用不同时间(24、48、72h)对A2780和A2780/DDP细胞凋亡的影响和此动态变化过程中半胱天冬氨酸蛋白酶?2(Caspase?2)和?3(Caspase?3)表达。结果 顺铂对A2780和A2780/DDP细胞系凋亡的诱导呈时间和剂量依从性。细胞凋亡蛋白Caspase?2和Caspase?3的活化促进顺铂诱导的凋亡,其表达呈现出对顺铂作用时间和剂量的依从性。结论 (1)在顺铂耐药机理中,药物在体内分布和代谢,对血药有效浓度的影响和细胞对药物排斥引起顺铂进入细胞存在一定的阻碍可能是降低顺铂敏感性的因素。(2)Caspase?2和caspase?3蛋白活化延后和活性降低可能是影响耐药A2780/DDP细胞凋亡的原因。

【关键词】  顺铂耐药;凋亡;Caspase?2;Caspase?3;人卵巢癌

    Cisplatin?Induced Apoptosis in Cisplatin?resistant Ovarian Cancer Cell Line A2780/DDP on Time? and Dose? Dependence

     Key words:Cisplatin?resistance;Apoptosis;Caspase?2;Caspase?3;Human ovarian caner

    卵巢癌细胞顺铂耐药是降低患者5年生存率的关键问题。耐药的卵巢癌细胞表现为自发凋亡能力明显下降和癌细胞无限制恶性增殖生长 [1]。顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡过程中最显著的变化是细胞内经线粒体凋亡途径激活[2]。从时间和剂量角度把握顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和耐药细胞A2780/DDP发生凋亡的变化规律,了解在凋亡上游途径起传导信号作用的Caspase?2蛋白和下游起执行作用的Caspase?3蛋白表达变化方式,将有助于进一步理解卵巢癌顺铂耐药机制。

    1材料与方法

    1.1人卵巢癌细胞系 

    A2780和A2780/DDP均购自同济肿瘤中心,A2780/DDP细胞系对顺铂的耐药是A2780细胞系的9.4倍[3]。用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基,在37℃、5%CO2、相对湿度90%的培养箱中培养。

    1.2主要试剂 

    顺铂(批号H37021358):山东齐鲁制药厂产品,分子量为300.3。考马斯亮兰蛋白质测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Caspase?2(BA0587,200μg/ml)、Caspase?3(BA0588,200μg/ml)和actin(200μg/ml)兔多克隆抗体、细胞凋亡检测试剂盒(MK1020),即用型SABC免疫组化染色试剂盒(SA1022)、蛋白质印迹(Western blotting)检测试剂盒(SA2022)、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司。

    1.3主要方法

    1.3.1顺铂对卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP生长抑制效果  MTT法测定,顺铂终浓度分别为0、2、5、10、20、40、80、200μmol/L(μM),分别培养24、48、72h;不同浓度顺铂对细胞生长抑制率:抑制率=(对照组A均值-实验组A均值)/对照组A均值。

    1.3.2顺铂对卵巢癌细胞系A2780和A2780/DDP凋亡诱导  根据1.3.1结果,选择5种顺铂浓度(0、5、10、20、40μmol/L)分别诱导细胞凋亡24、48、72h后终止实验作成细胞爬片或收集细胞,实验1.3.3~1.3.5均按此方法进行。

    1.3.3末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT)原位标记法检测细胞凋亡和判断标准  根据试剂盒步骤检测。阳性及半定量判断标准:细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞。阳性半定量方法为:每例(400×镜下)选取9个视野,即玻片左、中、右3区各取前、中、后3个视野,计算各视野内卵巢癌细胞数和阳性细胞数,计算其阳性细胞的百分比例。

    1.3.4Caspase?2蛋白在顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP凋亡中表达  提取卵巢癌细胞蛋白质;测定蛋白质浓度;蛋白质的SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳;将蛋白样本转膜;按试剂盒所示行蛋白质印迹法检测。其中一抗效价为1∶400~1∶500,选对照为actin(50μg)。

    1.3.5顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP凋亡中Caspase?3蛋白检测和判断标准:按免疫组化SABC方法进行,加入一抗效价为1∶100。阳性判断标准:细胞核或胞浆呈棕黄色至深棕色者为阳性细胞。阳性半定量方法同1.3.3所示。

    1.4统计学方法

    采用SPSS11.0统计软件包,对计量资料进行方差齐性检验。方差齐性者,用单因素方差分析(one?way ANOVA)检验总体均数差异性,有显著性差异者再进行两两比较(Student?Newman?Keuls Test)。P<0.05为差异有显著性。

    2结果

    2.1顺铂对卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP生长抑制

    顺铂对A2780细胞系生长抑制呈明显剂量时间依赖关系:顺铂作用48h后,明显抑制A2780细胞生长,其中20μmol/L为顺铂作用48h半数抑制剂量。顺铂对A2780/DDP细胞生长抑制也呈剂量时间依赖关系,特点是:效应强度明显弱于A2780细胞,尤以低于40μmol/L浓度效应弱于A2780中相应剂量;效应时间明显滞后, 72h才出现稍明显生长抑制。故本研究选定4个不同浓度(5、10、20、40μmol/L)顺铂在以下实验中作为刺激浓度来诱导A2780和A2780/DDP凋亡。

    2.2TDT原位标记法检测卵巢癌细胞凋亡

    顺铂培养A2780和A2780/DDP细胞72h内,发生凋亡细胞率呈时间剂量依赖,这种趋势在A2780细胞中明显。(10~40)μmol/L顺铂作用A2780细胞48h和(5~40)μmol/L的顺铂作用A2780细胞72h,凋亡数均明显多于其相同剂量作用24h者。对A2780/DDP细胞而言,只有当20μmol/L和40μmol/L顺铂作用72h时,细胞凋亡数才明显多于其相同剂量作用24h者,见表1。表1顺铂作用A2780和A2780/DDP凋亡阳性细胞计数结果A2780细胞P<0.05:各时间组间;24h组中从20μM顺铂组起, 48h组和72h组中从10μM顺铂组起,阳性细胞率明显增多。A2780/DDP细胞P<0.05:72h组中20μM和40μM顺铂组较24h和48h两组中相同剂量诱导者明显增多

    2.3Western blot检测Caspase?2蛋白表达

    Caspase?2基因编码的两个蛋白Caspase?2L和Caspase?2S在两个卵巢癌细胞系中均有不同程度表达, Western blot中检测的Caspase?2蛋白表达变化实际上是指48Kda的Caspase?2L蛋白的改变,其35Kda的Caspase?2S蛋白变化不明显(无特殊说明,以下Caspase?2指Caspase?2L)。A2780细胞中Caspase?2蛋白在顺铂作用24h和48h时,从10μM顺铂开始其表达增高;随着顺铂作用时间延长,到72h时,从5μM顺铂即开始表现增高。A2780/DDP中Caspase?2蛋白表达在顺铂作用24h和48h的各剂量组间表达无明显变化;等到顺铂作用72h后,从10μM顺铂起,Caspase?2表达开始增高,见图1、2。

    2.4Caspase?3蛋白在顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP凋亡中表达

    Caspase?3蛋白病理表现形式主要为胞浆和胞核同时着色,尤以胞核着色明显。其在A2780细胞表达随顺铂作用时间延长和剂量增加有明显增多趋势,这种趋势尤其显著体现为:24h组中从20 μM顺铂组起,48h组和72h组中从10μM顺铂组起,阳性细胞率明显增高。Caspase?3蛋白在A2780/DDP细胞中表达,5μM和10μM顺铂作用下随时间改变不明显,当顺铂剂量为20μM和40μM时,作用72h后Caspase?3蛋白表达有明显提高,但这种效应仍明显低于A2780细胞中,见表2。

    3讨论

    3.1顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和A2780/DDP凋亡的时间和剂量依从性

    肿瘤细胞对化疗耐药的机制是多方面的[4]。研究发现卵巢癌细胞系A2780和顺铂耐药系A2780/DDP对顺铂敏感性呈时间和剂量依从关系。随着顺铂作用时间延长和剂量增加,对两细胞系生长均呈明显抑制,出现时效和量效相关性。说明在顺铂耐药机制中,药物在体内分布和代谢,对血药有效浓度的影响可能是顺铂敏感性降低的因素之一。随着剂量增加,细胞内外药物浓度梯度增加,进入细胞内趋向性增强。这一现象表明卵巢癌细胞对顺铂敏感性差可能与顺铂进入细胞存在一定的阻碍。

    比较研究A2780和A2780/DDP两个细胞系发现,A2780/DDP需要更高浓度和更长作用时间,才能得到与A2780相同的效果,耐药细胞对药物的进入可能有排斥效果。在临床上考虑药物代谢和分布的影响,若提高到与体外实验相同敏感的剂量,人体是难以耐受其副作用的。这一现象提示在临床上可用靶向方法以提高局部药物浓度达到治疗作用。在除外剂量这一因素后,随着作用时间延长,A2780/DDP耐药系出现对顺铂敏感,尽管A2780/DDP对顺铂耐药,随着作用时间延长,这种耐药会被消弱。

    3.2细胞凋亡蛋白Caspase?2和Caspase?3在顺铂诱导卵巢癌细胞A2780和耐药细胞A2780/DDP凋亡中的表达呈时间和剂量依从性

    本研究发现Caspase?2L和Caspase?2S蛋白在两个卵巢癌细胞系中均有表达,其中Caspase?2L蛋白无论从表达量还是变化形式来说,都是A2780和A2780/DDP两个细胞系中最主要的表达形式,因此Caspase?2对这两种细胞凋亡均起正性效应[5]。在顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的动态变化过程中观察Caspase?2蛋白变化情况,则能较好地反映Caspase?2的活性。随着顺铂作用时间延长和剂量增加,Caspase?2蛋白的表达呈时间和剂量依从性,这种趋势在A2780中尤为显著。进一步研究显示这种时间和剂量的依从性与相同条件下顺铂诱导A2780和A2780/DDP细胞凋亡的时间和剂量依从性的变化相吻合。Caspase?2蛋白在顺铂敏感系A2780和耐药系A2780/DDP中发挥效应时间和程度不等,它仍可能是这两个细胞系中在顺铂诱导凋亡中起重要作用的Caspase。耐药卵巢癌细胞Caspase?2蛋白活化延后和程度降低,其上游激活途径可能受到了明显抑制。Caspase?3是一种重要的凋亡效应蛋白,它可对Caspase?2参与的线粒体调节和随后线粒体发生的变化起反应,执行凋亡命令[6]。Caspase?3蛋白在顺铂诱导A2780和A2780/DDP细胞系凋亡中的表达方式与Caspase?2蛋白类似,即Caspase?3蛋白表达呈时间和剂量依从性,在顺铂敏感细胞系突出,且时间和剂量依从性与相同条件下顺铂诱导凋亡的时间和剂量依从性变化一致。有所区别的是Caspase?3在耐药系A2780/DDP的活性明显弱于Caspase?2蛋白。Caspase?3蛋白在卵巢癌细胞系A2780和A2780/DDP中病理表现形态多样化,如胞浆型、胞核型和胞浆胞核型,以胞浆胞核型最常见。从侧面可能反映了Caspase?3蛋白在顺铂诱导凋亡中功能活跃。Caspase?2和Caspase?3蛋白在顺铂诱导其敏感细胞系A2780和耐药系A2780/DDP凋亡中表达均呈时间和剂量依从性,共同表达方式提示这两种蛋白表达变化可能与其编码基因突变导致的蛋白活性丧失或降低关系不大,而与一些外界因素,如进入细胞内的有效药物浓度密切相关,当接触到足量药物和作用时间延长,这两种蛋白在顺铂耐药的细胞中均能被活化,发挥作用。

    综上所述,在顺铂耐药机制中,药物在体内分布和代谢,对血药有效浓度的影响和细胞对药物排斥引起顺铂进入细胞存在一定的阻碍可能是降低顺铂敏感性的因素。Caspase?2和Caspase?3蛋白活化延后和活性降低可能是影响耐药的A2780/DDP细胞凋亡的原因。在初次治疗卵巢癌或对已耐药的卵巢癌的治疗中,应尽可能用提高局部药物浓度或中小剂量持续应用的方法,可能会产生一些积极的效果。

【】
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