PTEN在胃癌细胞中的表达及其CpG岛甲基化状态的研究

              作者：刘芬，于皆平，邓全军，齐元玲，于红刚    

【摘要】  　　目的 检测抑癌基因PTEN在四种胃癌细胞中mRNA和蛋白表达水平及其 5’启动子区CpG岛甲基化状态。方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应（Methylation?specific PCR,MSP）检测四种不同分化程度的胃癌细胞（HGC?27,MGC?803,BGC?823,SGC?7901）中PTEN基因启动子区域甲基化状态，RT?PCR和Western blot法分别检测其mRNA和蛋白表达水平。结果 除SGC?7901外，其他三种细胞可检测到PTEN基因启动子的甲基化。PTEN mRNA和蛋白表达水平依次为：SGC?7901最高(P<0.01)，BGC?823、MGC?803次之(两者间无显著性差异,P>0.05)，HGC?27表达水平最低(P<0.01)，其表达与细胞分化程度呈正相关趋势。结论 PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活，使其蛋白表达减少甚至缺失，这可能是导致胃癌发生、的原因之一。

【关键词】  胃癌　PTEN基因　甲基化

　　Studying the Expression of PTEN and Its CpG Island Methylation Status in Gastric Carcinoma Cells

        Department of Gastroenterology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，ChinaAbstract：Objective  To detect hypermethylation status of the 5’ CpG island locating in the promoter region of PTEN gene and the expression level of their mRNA and protein in 4 gastric carcinoma cells. Methods  Using  methylation?specific PCR(MSP) technique to detect methylation status of PTEN gene in 4 different differentiation gastric cancer cells(HGC?27,MGC?803,BGC?823,SGC?7901),RT?PCR and Western blot technique to detect their mRNA and protein expression level. Results  Except SGC?7901,other three cells were detected hypermethylation of PTEN gene. The mRNA and protein expression were highest in SGC?7901(P<0.01),higher in BGC?823、MGC?803(P<0.01) and lowest in HGC?27(P<0.01). The level of PTEN mRNA, protein expression and their differentiation were correlated. Conclusion  Hypermethylation can inactivate the transcription of PTEN and reduce its protein expression. It may be a considerable mechanism which leads to oncogenesis, metastasis of gastric carcinoma.

    Key words：Gastric carcinoma; PTEN gene; Methylation

　胃癌的发生涉及癌基因功能增强，抑癌基因突变或功能缺失。作为第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因PTEN（Phosphates and Tension homolog deleted on chromosome Ten），在多种肿瘤中存在失活现象，其失活的原因除突变、缺失外，5’CpG岛异常甲基化可能是其失活的第三条途径。本研究采用敏感的甲基化特异性PCR（MSP）方法检测PTEN基因启动子在四种不同分化程度的胃癌细胞中的甲基化状态，并通过RT?PCR和Western blot法检测该四种细胞中PTEN mRNA水平和蛋白表达，探讨PTEN甲基化改变、表达异常与胃癌的关系，为胃癌的发生机制提供分子生物学依据，以期为胃癌的探索新途径。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞系  胃癌细胞HGC?27(未分化),MGC?803,BGC?823(低分化),SGC?7901(中分化)购自上海生命研究院。

    1.1.2  主要试剂  Trizol试剂盒，RPMI1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；亚硫酸氢钠，氢醌，鼠抗人β?actin抗体，硝酸纤维素膜(Sigma公司)；Wizard DNA clean up system(Promega公司)；Sss?1酶(New England Biolabs公司)；小鼠抗人PTEN抗体，ECL试剂盒(Santa Cruz公司)；PTEN甲基化和未甲基化引物及PTEN和β?表1  用于MSP、RT?PCR各引物序列、产物大小和退火温度注：MSP两对引物中经亚硫酸氢钠处理后改变的碱基用黑体字标出，甲基化和非甲基化引物序列中碱基的不同用下划线标出ctin引物由上海生工合成。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  4种细胞用含10%胎牛血清(56℃灭活30min)，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的RPMI?1640培养液(pH7.2)，在37℃、5 %的CO2培养箱中培养。

    1.2.2  RT?PCR检测PTEN mRNA水平  Trizol一步法提取细胞总RNA，经逆转录后再以cDNA为摸板扩增。PTEN基因和β?actin的引物序列，见表1。PTEN PCR反应条件：94℃ 3min，以94℃30s，54℃30s，72℃45s循环20次，72℃延伸7min；β?actin PCR反应条件：94℃ 3min，以94℃40s，56℃45s，72 ℃60s循环20次，72 ℃延伸7min。1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照并检测吸光度值，将PTEN与β?actin吸光度比值作为其mRNA水平的相对值。重复实验6次，取均值。

    1.2.3  Western Blot法检测PTEN基因蛋白表达水平  提取细胞总蛋白，Bradford法测蛋白浓度。10％PAGE凝胶电泳，电转，加入一抗二抗，显色。暗室内X光底片感光成像并进行图像分析，条带的积分吸光度(IA)，将PTEN与β?actin吸光度值的比值作为其蛋白表达的相对值。上述步骤重复6次，取均值。

    1.2.4  DNA的提取、修饰和纯化  用经典的蛋白酶K?苯酚?氯仿法抽提细胞DNA，参照Herman的方法[1]，依次采用氢醌及亚硫酸氢钠，Wizard DNA clean up试剂盒修饰，纯化DNA。完全甲基化对照是将正常人外周血淋巴细胞DNA与SAM(终浓度160μM),1×NEBuffer2和1U的Sss?1酶共同37℃孵育2h后再经亚硫酸氢钠修饰；完全未甲基化对照仅用亚硫酸氢钠处理；阴性对照分别用没有经亚硫酸氢钠处理的DNA和H2O代替模板DNA进行PCR。

    1.2.5  MSP  引物设计根据PTEN基因序列(GenBank accession number AF143312),MethPrimer软件，并参照Salvesen HB,Kang GH,Kang YH等[2?4]合成，见表1。25μl PCR反应总体系为：10×Taq酶Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl(终浓度200μM)，Taq酶0.5μl(1u)，上下游引物各25pmol，MgCL 1.0μl，模板DNA 2～3μl，补足水至25μl。反应条件为：94℃热启动11min后开始35个循环：94℃40s，63℃45s，72℃1min，最后于72℃延伸12min，4℃保存。产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溴化乙锭染色后在紫外光下观察，凝胶成像系统拍照。

    1.3  统计学分析

    所有数据用±s表示，用SPSS11.5软件进行统计学分析，P<0.05为差异有显著性。

    2  结果

    2.1  PTEN mRNA和蛋白表达水平  见表2。

    mRNA和蛋白水平SGC?7901细胞显著高于HGC?27细胞(t=18.1536,P<0.01)及MGC?803和BGC?823细胞(t=9.010,P<0.01；t=7.4567,P<0.01)，后两者显著高于HGC?27细胞(t=9.14,P<0.01；t=10.697,P<0.01)，但是MGC?803和BGC?823细胞之间蛋白表达水平无明显差异(t=1.5535,P>0.05)。如图1、2所示。可见随着胃癌细胞分化程度的降低，PTEN mRNA和蛋白表达逐渐减少，两者呈正相关趋势。表2  四种胃癌细胞中PTEN mRNA和 蛋白表达水平

    2.2  PTEN基因启动子区CpG岛的甲基化状态

    HGC?27(未分化)、MGC?803、BGC?823(低分化)细胞，两种引物均有目的片段的扩增，提示了这三种细胞PTEN基因CpG岛发生了部分程度甲基化，SGC?7901(中分化)只有PTEN?U有目的片段的扩增，提示其没有发生甲基化。完全甲基化阳性对照只扩增出206bp的条带，完全未甲基化阳性对照只扩增出162bp的条带，阴性对照均无目的条带扩增，见图3。

    3  讨论

    自从抑癌基因PTEN被发现，至今已发现包括胃癌在内的多种肿瘤中都存在着PTEN改变，如子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌[5?8]。肿瘤细胞中导致PTEN基因沉默的原因之一是缺失和突变；导致PTEN沉默的另一原因即是其5’启动子区的CpG岛甲基化。PTEN基因的CpG岛甲基化将导致转录抑制，进而导致其表达产物PTEN蛋白的减少甚至缺失。

    本实验研究了四种胃癌细胞甲基化状态及其mRNA水平和蛋白的表达。HGC?27(未分化)、MGC?803、BGC?823(低分化)细胞PTEN基因启动子区CpG岛可检测到甲基化，SGC?7901(中分化)细胞则未检测到甲基化，且细胞分化程度越低，PTEN mRNA与蛋白表达水平越低。这一结果与Kang等［3］、Kang等［4］的报道一起说明PTEN在人胃癌细胞和组织中均发生了一定程度的甲基化，这可能是引起PTEN mRNA表达减少并导致其蛋白表达减少或缺失的机制之一，但是，Sato等[9]研究却认为PTEN并未发生甲基化。这可能是由于PTEN基因启动子区富含的CpG岛并未全部发生甲基化，在进行PCR扩增中所设计的引物并未能针对已发生甲基化的区域扩增。另外，不同细胞株(即使是同一细胞株的不同细胞)来的DNA甲基化程度可能不一样，这都是导致结论不一的原因。另外我们发现，PTEN mRNA和蛋白表达水平与细胞分化程度呈正相关趋势。一般来说，细胞分化程度越低，其恶性程度就越高，病人预后越差。

    此实验通过对PTEN基因表达和甲基化状态的研究，为胃癌的发生机制提供了分子生物学依据，也为肿瘤的提供了新的思路。但该结果仅从DNA、RNA和蛋白水平分析PTEN在胃癌发生中的异常改变，其参与肿瘤发生发展的机制还有待于进一步研究。

【】
  　　［1］ Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylation?specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996,93 (18): 9821?9826.

[2] Salvesen HB, Stefansson I, Kretzschmar EI, et al. Significance of PTEN alterations in endometrial carcinoma: a population?based study of mutations, promoter methylation and PTEN protein expression[J]. International Journal of Oncology, 2004,25 (6):1615?1623.

[3] Kang GH, Lee S, Kim WH, et al. Epstein?Barr Virus?Positive Gastric Carcinoma Demonstrates Frequent Aberrant Methylation of Multiple Genes and Constitutes CpG Island Methylator Phenotype?Positive Gastric Carcinoma[J]. American Journal of Pathology, 2002, 160 (3):787?794.

[4] Kang YH, Lee HS, Kim WH, et al. Promoter methylation and silencing of PTEN in gastric carcinoma[J]. Laboratory Investigation, 2002,82 (3):285?291.

[5] Schondorf T, Ebert MP, Hoffmann J, et al. Hypermethylation of the PTEN gene in ovarian cancer cell lines[J]. Cancer Letters,2004, 207 (2): 215?220.

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[7] Khan S, Kumagai T, Vora J, et al. PTEN promoter is methylated in a proportion of invasive breast cancers[J]. International Journal of Cancer,2004, 112 (3): 407?410.

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[9] Sato K, Tamura G, Tsuchiya T, et al. Analysis of genetic and epigenetic alterations of the PTEN gene in gastric cancer[J]. Virchows Archiv,2002,440 (2): 160?165.