c?erbB?2反义寡核苷酸对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用
作者：吴永忠,任庆兰,李少林
【摘要】 目的 探讨c?erbB?2基因反义寡核苷酸转染对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及其分子机制。 方法 实验分空白对照组、正常对照组、c?erbB?2正义对照组及c?erbB?2反义组。脂质体转染后不同时间分别进行MTT试验、集落形成试验、荧光显微镜检测、蛋白质荧光强度测定，以观察不同条件处理后各组细胞的增殖、凋亡、蛋白质表达有无差别。 结果 反义治疗组与正义对照组比较：转染72h OD值分别为0.201与1.298（P＜0.01）；克隆形成率分别为26.5%与76.5%（P＜0.05）；凋亡率分别为21.3%与7.5%（P＜0.05），同时明显地下调c?erbB?2蛋白质的表达水平（P＜0.05）。结论 在卵巢癌的基因治疗中，c?erbB?2反义寡核苷酸能明显抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖。
【关键词】 SKOV3细胞 反义寡核苷酸 卵巢癌 c?erbB?2基因
Inhibitory Effects of c?erbB?2 Antisense Oligodeoxynucleotides Transfection on the Human Ovarian Carcinoma SKOV3 Cell Lines
. Key words：SKOV3 cell lines;Antisense oligodeoxynucleotides;Ovarian carcinoma;c?erbB?2 gene
卵巢癌已成为女性生殖系统恶性肿瘤死亡的首位原因。美国每年新发病率达到23 000例左右［1］。其总的5年生存率不到30%[2]。近30年来，卵巢癌发病率上升了3倍，治疗手段虽有改进，疗效却仍然不令人满意。有作者指出生物治疗在卵巢癌的治疗中将起关键性的作用[3]，在分子水平上控制卵巢癌的发生可能成为最大的希望。本课题采用c?erbB?2反义寡核苷酸联合转染的方法，通过一系列实验，在细胞水平观察它们对人卵巢癌SKOV3细胞株增殖的抑制作用及其初步分子机制。
1材料与方法
1.1材料
SKOV3细胞株购自重庆医科大学基础医学院肿瘤研究室。阳离子脂质体（lipofectin）购自美国sigma公司。c?erbB?2正义脱氧寡核苷酸（SODN）序列为：5′?GGTTCACACGTGGCC?3′，c?erbB?2 ASODN序列为5′?CCAAGTGTGCACCGG?3′[4]。所有SODN与ASODN均由上海生物公司合成并全部经硫代磷酸化修饰。RPMI?1640培养基、小牛血清、各种抗体等试剂均购自美国hyclone公司。转染液为自制的无血清无抗生素RPMI?1640培养液。实验所用仪器均由重庆医科大学分子生物学实验室提供。
1.2方法
1.2.1细胞培养SKOV3细胞在37℃、5%CO2条件下、含10%小牛血清的RPMI?1640培养液中培养。传代培养时，将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化2～5min后，用RPMI?1640培养液终止消化，在低速离心机上1 500r/min离心5min，弃上清，再用PBS液重悬细胞，再离心5min。利用ELX800微孔板读数仪调整细胞浓度后，接种到新的培养瓶。
1.2.2实验分组 共设立4组：0组:空白对照组，仅予以转染液处理;I组:正常对照组，阳离子脂质体lipofectin + 转染液;Ⅱ组:正义治疗组，c?erbB?2 SODN + lipofectin + 转染液;Ⅲ组:反义治疗组，c?erbB?2 ASODN+ lipofectin + 转染液。
1.2.3脂质体转染方法按照产品说明书进行，脂质体与寡核苷酸的比例为1∶4。
1.2.4MTT试验脂质体转染20h后再分别培养24、48、72h。培养48h时换液一次。到相应终止时间，弃原培养液，每孔加入转染液90μl，再加入MTT（5mg/ml）10μl，放入CO2孵箱中孵育4h。弃上清，每孔加入DMSO 100μl，震荡10min。酶联免疫检测仪570nm波长比色。
1.2.5平板集落形成试验脂质体转染20h后，吸去上清液，用0.25%胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为103/ml。取9cm培养皿24个，每组3个平行皿，分别预置10ml普通培养液，做好分组标志。每皿接种单细胞悬液各200μl，即细胞数为200个/皿，然后十字方向轻巧晃动培养皿，使细胞分散均匀。将培养皿移入CO2孵箱中，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，静止培养2.5周。肉眼下计数细胞形成的集落数，对难以判断者，在显微镜下计数＞50个细胞的集落数。
集落形成率（%）＝计数细胞集落数/200×100%。
1.2.6AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡脂质体转染20h后，弃上清，加入RPMI?1640培养液再培养72h。培养48h时换培养液一次。新鲜配制AO/EB混合液，AO(100μg/ml)与EB(100μg/ml)按1∶1混合即可。培养72h终止实验，用无菌小镊子取出盖玻片，置于载玻片上，加AO/EB混合液一滴于盖玻片上，荧光显微镜下计数。
凋亡率（%）=(VA＋NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。
1.2.7流式细胞仪检测c?erbB?2蛋白（p185）
脂质体转染20h后，弃上清，加入RPMI?1640培养液再培养72h。吸去上清液，常规消化细胞，1 500r/min离心5min，弃上清。用4℃ PBS重悬细胞后，移至EP管中，再次1 500r/min离心5min。重复上一步一次。各加入1%福尔马林液固定2h， 1 500r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤细胞3次。各加入0.5%皂角素1ml，室温静置15min，1 500r/min离心5 min，弃上清，用PBS洗涤细胞3次。各加入1∶10鼠抗人单克隆抗体IgG 50μl，置室温1h，PBS洗涤细胞3次。各加入1∶5兔抗鼠FITC标记的抗体IgG 10μl，置室温1h。流式细胞仪检测c?erbB?2蛋白的荧光强度。
1.3统计分析
用SPSS 10.0统计软件处理。检测数据以±s表示，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，P＜0.05差异有显著性，P＜0.01差异有极显著性。
2结果
2.1MTT试验转染后24、48、72h，MTT检测结果，见表1。表1不同转染时间的OD值比较
2.2平板集落形成试验 见表2。表2各组克隆形成率比较
2.3荧光染色法检测细胞凋亡结果见表3表3荧光显微镜检查结果
2.4流式细胞仪检测c?erbB?2蛋白
通过流式细胞仪检测相应蛋白的荧光强度，可反映各组不同作用条件下，对细胞表达抑制程度的强弱，见表4。表4c?erbB?2蛋白p185荧光强度
3讨论
本研究采用Kim等[5]报道的脂质体与核苷酸的配制方法，二者的比例为1∶4时转染效率最高。根据报道，脂质体对细胞的生长有一定的影响，所以在本课题中为了排除脂质体的干扰，正常对照组也给予了脂质体处理。在MTT试验和平板集落试验中，我们另设了空白对照组，目的在于判断Liperfectin对本组实验的影响。结果表明，在本研究条件下，其影响程度较小。查阅文献，为了比较脂质体介导的不同ASODN之间的疗效，一般以脂质体为对照，而非单纯的空白对照。故本研究的其他实验，我们不再给出空白对照组的实验结果。
反义技术是阻断已知基因表达的有效方法，反义靶点的选择尤其重要，同时核苷酸序列碱基数目必须合适（15～20个碱基）。有研究 [6]采用全长c?erbB2反义核酸对SKOV3细胞生长抑制率不高，可能是降低了ASODN的特异性及对细胞的穿透性从而影响了ASODN的最佳发挥。选用针对c?erbB2 mRNA 5′端编码区互补的ASODN 5′?CAGCTCCATGG TGCT?3′[7]取得了对卵巢癌细胞增殖的较好抑制率。c?erbB?2是理想的基因靶点[8]。c?erbB?2 是EGFR家族中最重要成员之一，编码I型跨膜酪氨酸蛋白激酶型（tyrosine protein kinase， TPK）生长因子受体，分子量为185KD，在许多实体肿瘤中呈高表达，并与肿瘤的生物学行为密切相关，是EGFR介导的信号转导系统的关键基因之一，c?erbB?2是近年研究的热点之一[9]。本研究选用的c?erbB?2 ASODN与c?erbB?2 mRNA 5′端编码区互补[4]。
目前研究抗肿瘤药物对细胞增殖抑制作用的方法主要有两类：一是短期增殖抑制试验，包括细胞计数、MTT、3H?TdR掺入试验；二是持续增殖抑制试验，包括软琼脂糖克隆形成试验、平板集落形成试验。本实验采用MTT法和平板集落形成试验来观察c?erbB?2反义寡核苷酸联合转染对SKOV3细胞增殖的抑制作用。转染后24h，即显示出各组OD值有明显的不同，反义组对细胞增殖的抑制效果明显强正义治疗组；转染后72h，各组OD值差别更加明显，反义组对细胞增殖的抑制效果更加明显。随着时间的延长，反义治疗组OD值进行性降低，降低幅度在转染48h时最大。平板集落形成试验结果显示出与MTT试验结果具有很好的一致性。
表皮生长因子受体（EGFR）在许多恶性肿瘤中呈高表达，并与肿瘤的发生、转移、预后等有密切关系。c?erbB?2过表达的卵巢癌病人生存期明显缩短。Wiechen等[10]针对c?erbB?2 mRNA 5′端起始编码区下游33bp处设计合成硫代反义寡核苷酸，观察其对卵巢癌细胞株SKOV3的影响，结果发现它能降低p185蛋白的表达水平，对细胞生长的抑制率达60%。本组资料中，为了观察在蛋白水平上的情况，我们采用Vaughn等[11]报道的方法，通过流式细胞仪检测相应蛋白的荧光强度，可反映各组不同作用条件下，对细胞中相应基因表达抑制程度的强弱。结果显示c?erbB?2ASODN能明显下调p185蛋白的表达水平，这可能是其产生增殖抑制效果的分子基础之一。
在卵巢癌的基因治疗中，c?erbB?2反义寡核苷酸是一种有效的基因治疗手段，具有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、下调p185蛋白表达的作用。
【文献】
［1］ Wadler S.New developments in treatment of ovarian cancer［J］.Expert Opin Investig Drugs,2001,10(6):1167?1172.
［2］Harries M,Kaye SB.Recent advances in the treatment of epithelial ovarian cancer［J］.Expert Opin Investig Drugs,2001,10(9):1715?1724.
［3］ Ozols Robert F.Future directions in the treatment of ovarian cancer［J］.Semin Oncol,2002,29(1 supp1):32?42．
［4］ Funato T,Kozawa K,Fujimaki S,et al.Increased sensitivity to cisplatin in gastric cancer by antisense inhibition of the HER?2/neu (c?erbB?2) Gene［J］.Chemotherapy,2001,47(4):297?303.
［5］ Kim CK,Haider KhH,Choi SH.Nonviral vector for efficient gene transfer to human ovarian adenocarcinoma cells［J］.Gynecol Oncol,2002,84(1):85?93．
［6］ Wu L,Wu A,Jiang K,et al.Effect of antisense c?erbB2 on biologic behavior and chemotherapeutic drug sensitivity in human ovarian cancer cells［J］.Chung Hua Fu Chan Ko Tsa Chih,1996,31(3):169?172．
［7］ Shen M,Feng YJ,Ge BQ,et al.Effect of Liposome c?erbB2 Antisense oligodeoxynucleotides on human ovarian cancer cells［J］.Chung Hua Fu Chan Ko Tsa Chih,1999,34(8):485?487．
［8］ Yang SP,Song ST,Tang ZM,et al.Optimization of antisense drug design against conservative local motif in simulant secondary structures of HER?2 mRNA and QSAR analysis［J］.Acta pharmacologica Sinica,2003,24 (9),897?902．
［9］ James PV,Joanne S,Samuel D,et al.Inhibition of the erbB2 tyrosine kinase receptor in breast cancer cells by phosphoromonothioate and phosphorodithioate antisense oligonucleotides［J］.Nucleic Acids research,1996,24(22);4558?4564．
［10］Wiechen K,Dietel M.c?erbB?2 antisense phosphorothioate ologodeoxynucleotides inhibit growth and serum?induced cells spreading of p185c?erbB?2?overexpression ovarian carcinoma cells［J］.Int J Cancer,1995,63(4):604?645.
［11］Vaughn JP,Iglehart JD,Demirdji S,et al.Antisense DNA downregulation of the erbB?2 oncogene measured by a flow cytometric assay［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(6):8338?8342.
