肿瘤坏死因子基因多态性与多发性骨髓瘤的 临床相关关系
【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha,TNFα）基因–308位和淋巴毒素（Lymphotoxin?α,LTα）基因+252位基因多态性与多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）发病、临床及预后的相关关系。方法 用聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶消化及电泳技术，对32名MM患者和72名正常对照者的TNFα和LTα基因的单碱基突变多态性进行检测，并收集病人组的临床资料，进行生存状况分析。结果 (1) MM病人TNF两位点基因型频率、等位基因频率、联合单倍体分型中各型的频率与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；(2)比较MM病人两位点联合单倍体分型在不同性别、分期、肿瘤负荷、血红蛋白、血钙、血肌酐中的分布，没有发现显著性差异（P>0.05）；(3)用Kaplan?Meier方法进行生存分析，没有发现高危型与低危型的总生存时间有显著性差异：在高危型组和低危型组，2年生存率和4年生存率差异无统计学意义（P>0.05）；Cox回归模型显示两位点联合单倍体分型不是影响预后的危险因素（P>0.05）。结论 本组研究显示TNFα–308位、LTα+252位基因多态性在MM病人发病的易感性、临床和预后中可能不起重要作用。
【关键词】 多发性骨髓瘤 肿瘤坏死因子 基因多态性
0 引言
多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是来源于淋巴细胞系统的异常浆细胞过度增生的恶性肿瘤。有研究发现肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor alpha, TNF)可诱导MM细胞形成自分泌IL?6环路；在骨髓，TNF与其它细胞因子形成一个细胞因子调控，调节MM细胞的生长。故一般认为，TNF可能与MM的发生或相关。淋巴毒素（LTα，又称为TNFβ）与TNF?α同属一细胞因子家族，二者生物学效应类似。TNFα和LTα的基因多态性有可能通过影响这两种细胞因子的表达，进而影响MM的发生与发展。为探讨TNF?α和LTα基因多态性与人MM发病、临床和预后的相关性，我们对32名MM患者的TNFα和LTα基因的单碱基突变多态性进行检测，了解上述基因位点在广东地区MM病人中的分布情况，并对其进行临床观察与随访研究。
1 材料与方法
1.1 研究对象 （1）MM组：32例，为2001年4月到2002年6月期间在中山大学第一附属、广东省人民医院住院确诊的MM患者, 年龄44～72岁，中位年龄59岁；（2）对照组：72例，选自同期献血员和中山大学第一附属医院教职工，其中男性43名、女性29 名，中位年龄24岁。上述所有观察对象均为广东汉族, 彼此间无亲缘关系。
1.2 TNFα、LTα基因目的片段多态性的检测
1.2.1 DNA提取 两组均取外周静脉血1ml, EDTA抗凝， NaI法抽提基因组DNA。 -80℃保存。
1.2.2 TNFα基因多态性片段的扩增 扩增含TNFα–308位多态性位点片段的正反引物是5′?AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT?3′和5′?TCCTCCCTGCTCCGATTCCG?3′。PCR扩增体系50μl，含10×Buffer 5μl（含1.5mmol/L MgCl2 ），2mmol/L dNTP 2.5μＬ，20mmol/L的正反引物各1μl，TaqDNA聚合酶（购自加拿大真达公司）2.5U，基因组DNA 100～150ng。先热启动，94℃预变性2min，再以下列温度和时间循环35次：94℃ 60s，60℃ 60s，72℃ 60s，最后再72℃ 延伸4min。循环中热盖温度103℃。扩增片段长度为107bp。
1.2.3 LTα基因多态性片段的扩增 扩增含LTα+252位多态性位点片段的正反引物分别是5′?CTCCTGCACCTGCTGCCTGGATC?3′和5′?GAAGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT?3′。PCR扩增体系（50μl），除20mmol/l的正反引物各0.6μl外，其余与TNFα的扩增体系相同。先95℃预变性10min，再95℃ 60s，64℃ 60s，72℃ 120s，如此循环31次，循环中热盖温度103℃。扩增片段长度为368bp。
1.2.4 NcoⅠ限制性内切酶消化扩增片段 取PCR扩增产物10μl，加入限制性内切酶NcoⅠ（购自宝生物公司）8U，依说明书加入BSA、10×K Buffer两种缓冲液各2μl, 37℃孵育5h，孵育结束后加2μl 10×Loding Buffer终止反应。两基因酶切方法和过程相同。
1.2.5 凝胶电泳 TNFα消化产物以8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压450V，电泳2.5h，0.012mol/l硝酸银染色后在凝胶上呈现深棕色条带，干胶保存。LTα消化产物以2.5% 琼脂糖凝胶电泳，100V 40min, 溴化乙锭（EB）染色，在紫外灯下观察结果，摄相保存。
1.3 诊断及随访
收集相关临床资料，分期、肿瘤量分级按多发性骨髓瘤诊断标准，制定追踪表，通过门诊或电话访问的形式了解疾病转归。每隔半年随访一次，随访截止时间是2003年4月。生存时间指从确诊至随访结束或死亡的时间。
1.4 统计学分析
采用SPSS 10.0机统计软件, 基因计数法计算各组基因型频率及等位基因频率；用Pearson 相关法分析两位点基因型间的相关关系；组间基因型、等位基因频率的比较及两位点联合单倍体分型与临床各指标间的关联性用卡方检验。用Kaplan?Meier方法进行生存分析，log?rank方法进行差异检验。用Cox回归模型评估TNF–308位和+252位联合单倍体分型对疾病预后的影响。以双侧P<0.05为有意义的标准。
2 结果
2.1 基因型的确定结果
2.1.1 TNFα-308位点基因型的确定 含TNF1等位基因的一条链上有NcoI的识别位点，含TNF2等位基因的一条链上无该酶识别位点。故酶切电泳图谱显示为：TNF1/1纯合子的PCR产物被内切酶NocI完全切断，形成87bp和20bp两条片段，TNF1/2杂合子的PCR产物仅部分切断，形成107bp、87bp及20bp 3条片段，TNF2/2纯合子由于特异酶切位点的消失，其PCR产物因不能被切断仅形成107bp一个片段。
2.1.2 LT α+252位点基因型的确定 LT α（10.5）等位基因的一条链上无NcoI的识别位点，LT α（5.5）等位基因的一条链上有该酶识别位点。故酶切电泳图谱显示为：LT α（10.5/10.5）纯合子的PCR产物不能被内切酶NocI切断，仅形成368bp一个片段；LT α（10.5/5.5）杂合子的PCR产物仅部分切断，形成368bp、235bp及133bp 3条片段；LT α（5.5/5.5）纯合子能被内切酶Noc I完全切断，形成235bp和133bp两条片段。
2.2 研究样本的群体代表性
对MM组和对照组中两个位点的基因型分布进行Hardy?Weinberg平衡检验，P值均大于0.05，确认两组研究样本具有群体代表性，是达到遗传平衡的群体。
2.3 两位点基因多态性的分布及相关性
2.3.1 TNFα-308位点基因型、等位基因在MM中的分布 对正常对照组和MM组进行基因型频率及等位基因频率的组间比较，结果显示在广东汉族对照组及MM病人人群中TNFα-308位点基因型频率及等位基因频率的分布均无显著性差异。
2.3.2 LT α+252位点基因型、等位基因在MM中的分布 MM患者三种基因型的频率与对照相比，差异无显著性（χ2 =0.857,P=0.651）,等位基因频率较正常组差异也无统计学意义高（χ2 =0.285,P=0.593）。
2.3.3 TNF α-308 /LTα+252位点联合单倍体分型在MM和对照组中的分布 用χ2检验分析发现TNFα-308/LTα+252两位点各基因型在MM病人中有相关关系（χ2=12.023，P= 0.017）。
2.4 TNFα–308 /LTα+252位点联合单倍体分型在MM组、对照组群中的分布
因两多态性位点相关且TNF2和LTα（5.5）等位基因可能增加TNF的产量，这促使本研究采用两位点联合单倍体分型而不是单位点来评估TNF基因多态性在临床和预后中的作用。将TNF2和LTα（5.5）等位基因视为高产型等位基因，联合单倍体分析的方法将上述两位点含两个及以上高产等位基因的定义为高危型，反之则为低危型。高危型包括TNF1/2和LT α（10.5/5.5）,TNF2/2和LT α（10.5/10.5），TNF1/1和LT α（5.5/5.5），TNF1/2和LT α（5.5/5.5）， TNF2/2和LT α（10.5/5.5），TNF2/2和LTα（5.5/5.5）；低危型包括TNF1/1和LTα（10.5/5.5）,TNF1/2和LTα（10.5/10.5），TNF1/1和LT α（10.5/10.5）。对正常组和MM组进行TNFα-308 /LT α+252位单倍体基因高危型、低危型组间比较，结果显示在广东汉族对照组及MM病人人群中单倍体基因高危型、低危型分布无显著性差异。
2.5 TNFα–308位和/LTα+252单倍体分型与MM的临床与预后的相关关系分析
用χ2检验分析TNF α-308位和/LTα+252单倍体分型在MM病人的性别、分期、肿瘤负荷、血红蛋白、血钙、血肌酐中的分布，没有发现两位点单倍体分型在上述临床指标中的分布有显著性差异。对以上病人进行追踪随访，追踪时间3～96个月，平均27.5个月，其中有21名病人死亡。用Kaplan?Meier方法进行生存分析，发现高危型与低危型的总生存时间无显著性差异：高危型组平均生存时间为37.33个月，低危型组平均生存时间为25.02个月，其2年生存率为62.50%比50.23%, 4年生存率为25%比25.12%（Logrank检验，P=0.9786）。Cox回归模型显示TNFα-308位和LTα+252位联合单倍体状态分组不是影响预后的危险因素（P=0.069）。
3 讨论
近年来的研究表明，TNF对肿瘤的作用呈双向性，既可杀伤肿瘤细胞亦可促使肿瘤细胞生长和浸润 [1?3]。由于TNF在肿瘤免疫、感染和炎症、淋巴组织的发生和功能中有一定作用且内源性TNF的产生是由基因决定的，所以TNF基因可能影响恶性肿瘤尤其是淋巴组织来源肿瘤的发生和。影响TNF?α表达的多态性位点位于转录起始点上游308位（-308位）；影响LTα基因表达的多态性位点在该基因第一个启动子内，转录起始位点下游252位（+252位）[4,5]。本研究结果显示，广东汉族人群TNFα-308位多态性的基因型频率和等位基因频率在对照组和MM病人中无明显差别，这一结果与Zheng [6]在欧洲病人中的研究的结果相似，提示TNFα-308位点基因多态性在中国广东汉族MM病人发病的遗传因素中，可能不起重要作用。上述结果表明TNF?α对MM影响的调节与基因调控的TNF?α产生可能无关，其影响可能发生在MM病人TNF?α受体或受体后水平。同时，本研究未发现TNFα-308位/LTα+252位联合单倍体分型与发病易感性有关，而Davies[7]对英国MM病人的研究却表明携有TNFα/LTα高产基因型的病人更容易发展为MM。这说明在不同种族的人群TNF基因多态性对NHL发病易感性的影响是不同的，反映了基因多态性作为疾病易感性遗传标记的复杂性。
本研究分析比较了联合单倍体分型与MM病人性别、分期、肿瘤负荷分级、血红蛋白、血钙、血肌酐中的分布，没有发现单倍体分型与上述临床指标有关，高危型组病人总生存时间与低危型组比较无明显差异，Cox回归模型未能得出联合单倍体分型影响预后的结论。这说明病人机体对TNF释放的遗传调节能力在MM病情的发展演化中不起重要作用。这与最近Neben [8]的结果有类似之处，他们的研究发现德国难治性MM血清中TNFα水平及预后与TNF基因启动子-238位多态性而非-308位多态性有关。TNF基因有多个多态性位点，上述研究说明除考虑人种差异外，还应注意其它多态性位点在MM发病和病情发展中的作用。另外，一些研究显示TNFα和LTα与HLA基因簇内的另一些等位基因存在连锁不平衡。Wilson[9]曾提出–308位的TNF2等位基因与HLA-DR3等位基因存在连锁不平衡，对这些现象的机理还需作进一步的深入研究。总的来说，目前对这两个位点多态性与MM的研究国内外均还处于开始阶段，只有在考虑到其他TNF多态位点和种族差异、遗传异质性作用的基础上，进一步进行大样本的调查和连锁不平衡分析，才能明确TNF基因多态性与MM发生/发展间的关联性。
【】
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