DPC4基因在肺癌中的表达及其与微血管形成和凋亡的关系

【摘要】  目的 探讨DPC4(deleted in pancreatic carcinoma locus 4，DPC4)基因在非小细胞肺癌(non?small cell lung carcinoma,NSCLC)中的表达及其与微血管形成和凋亡的关系。方法 利用免疫组织化学S?P法检测52例NSCLC组织、19例相应的癌旁正常肺组织中DPC4、VEGF的表达，用CD34标记血管内皮细胞并微血管密度MVD值，应用TUNEL技术对细胞凋亡情况进行了检测并计算凋亡指数。结果 DPC4在肺癌原发灶中的阳性表达率为63.5%(33/52)，与癌旁正常肺组织中的阳性表达率89.5%(17/19)相比，DPC4阳性表达水平显著降低（P<0.05）;DPC4与组织学类型、肿瘤细胞分化程度无关（P＞0.05），但与淋巴结转移显著相关（P<0.05）。52例NSCLC中，DPC4的表达与VEGF、MVD值均呈负相关(r=-0.303, P =0.020)。DPC4阳性组凋亡指数(apoptotic index,AI)值明显高于DPC4阴性组（P<0.05）。结论 DPC4的低表达可能是肺癌发生过程的早期事件，并可通过直接或间接的作用促进肺癌血管生成，从而促进肺癌的淋巴结转移，DPC4的高表达可能促进细胞的凋亡。

【关键词】  DPC4 肺癌 免疫组化 血管生成 凋亡

  0  引言

    DPC4(deleted in pancreatic carcinoma locus 4，DPC4)是一种新的肿瘤抑制基因，其首先由Hahn SA等[1]于1996年在Science上报道，其蛋白产物Smad4是转化生长因子β(TGFβ)超家族受体的直接底物，而TGFβ具有抑制细胞生长和肿瘤转移等多种功能[2]，最近的研究显示DPC4除了在TGFβ信号传导途径中的中心作用以外，还具有一些独立于TGFβ的功能。如DPC4具有调节细胞粘附和侵入的潜在功能，以及抑制肿瘤组织的血管增殖和促进凋亡等[3]。但DPC4在NSCLC中的表达尤其与肿瘤微血管形成和凋亡的关系，国内外相关报道甚少。本研究应用免疫组化SP法检测了52例肺癌组织和19例相应的癌旁正常组织DPC4基因的蛋白表达，以探讨其在肺癌发病机制中的作用及其与微血管形成和凋亡的关系，为今后以DPC4基因为靶点对肺癌进行基因提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源

    标本来自湖北省肿瘤和武汉大学附属医院2000年3月至2003年7月肺癌手术患者52例，其中鳞癌25例，腺癌27例。高分化癌14例，中分化癌18例，低分化癌20例。伴淋巴结转移17例。另取癌旁正常肺组织19例。全部标本经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，制成4μm厚连续切片。

    1.2  试剂和方法

    鼠抗人DPC4、VEGF和CD34单克隆抗体购自Maxim?Bio公司，均为即用型。免疫组化SP Kit为Maxim?Bio公司产品。实验步骤按试剂盒说明进行，用PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性片作阳性对照，用DAB显色，苏木精复染。

    1.3  免疫组织化学结果判断

    DPC4和VEGF阳性颗粒主要分布于正常支气管上皮细胞和肿瘤细胞的胞浆（见图1、2），以细胞浆内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。显微镜下观察DPC4和VEGF蛋白的分布、阳性强度和阳性率。先按染色强度打分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，染色强度需与背景着色相对比；再按阳性细胞所占百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为＞75%，染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2分为免疫反应阳性（+）。

    MVD计数: 按照Weidner的标准[3]，在低倍镜下选取肿瘤微血管数量最丰富的区域，200倍视野范围计算3个视野的微血管数目，取其平均值作为MVD(±s)， 微血管判断标准是以肿瘤区内染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇， 均作为一个血管计数， 若有管腔大于8个红细胞大小及带有较厚肌层的血管或坏死区域的血管均不予计数。

    1.4  细胞凋亡检测

    采用改良的TdT介导的dUTP?biotin切口末端标记原位检测法。标记液及抗体购自德国Boehringer Mannhein公司。凋亡阳性染色位于细胞核,呈棕黄色。主要表现为核浓缩或核质呈均匀的染色,染色质边聚,无白细胞浸润（见图3）。随意挑选10个高倍镜视野下阳性细胞与总细胞比值为AI。

    1.5  统计学处理

    采用SPSS（11.5版）进行统计学分析，DPC4的表达与不同临床病理参数的关系采用χ2和Fisher’s精确检验，DPC4和VEGF的关系采用Spearman相关分析，DPC4与MVD和AI的关系采用t检验。

    2  结果

    2.1  NSCLC中DPC4的表达

    DPC4在癌旁正常肺组织和肺癌原发灶中的阳性表达率分别为89.5% (17/19)、63.5%(33/52) (P＜0.05）。由表1可知，在肺腺癌中DPC4的阳性率明显高于肺鳞癌，但P>0.05； 随着分化程度的降低，DPC4的阳性表达率呈下降趋势，但P>0.05；有淋巴结转移的肺癌组DPC4阳性率显著低于无淋巴结转移组P＜0.001。表1  NSCLC中DPC4的表达与临床病理特征的关系

　　2.2  NSCLC中DPC4表达同VEGF表达和MVD 间的关系

    VEGF表达阳性细胞多位于肿瘤的边缘(图2)。由表2可知，VEGF在DPC4阴性表达组的阳性率明显高于DPC4阳性组，二者呈明显的负相关(r=-0.303，P=0.020)。CD34阳性产物定位于肿瘤间质的血管内皮细胞(见图4) ， 免疫组化结果发现， 新生血管热点区在肿瘤侵袭边缘的间质中分布密度明显高于肿瘤的中央区域。NSCLC中MVD计数为17.20～83.16，平均值为53.42±13.15，DPC4表达阳性组MVD值为43.74±7.25， 显著低于DPC4表达阴性组61.77±7.09，差异有高度显著性（t = 8.474，P＜0.001），见表2。

    2．3  NSCLC中DPC4表达同凋亡指数间的关系

    NSCLC组织中癌细胞DPC4阳性肺癌组AI值高于阴性组（P＜0.05),见表3。

    3  讨论

    DPC4是新近克隆出的定位于人染色体18q    表2  NSCLC中DPC4表达与VEGF表达和MVD间的关系表3  NSCLC中DPC4表达与凋亡指数AI间的关系由于DPC4是TGFβ细胞内信号传导的枢纽，在肿瘤发生过程中起重要的作用，而TGF?β是细胞促有丝分裂反应的抑制物，因此DPC4也可被认为是一种肿瘤抑制剂[4]。Hahn等[5]发现64%的胰腺癌中DPC4蛋白阳性率降低。本组研究中，52例肺癌组织中DPC4表达阳性率为63.5%，其阳性率明显低于癌旁正常肺组织(89.5%)，二者差异有显著性（P＜0.05），提示肺癌组织内有DPC4(Smad4)蛋白的低表达，表明DPC4基因低表达与肺癌的发生有关，可能是肺癌发生过程的早期事件。众多研究发现，DPC4(Smad4) 表达缺失与组织细胞分化有关，分化越差的恶性肿瘤，其DPC4 (Smad4) 缺失率越高。然而，本研究显示DPC4阳性表达与肺癌组织类型，分化程度却无相关性，但在有淋巴结转移的肺癌组中其阳性率显著低于无淋巴结转移的肺癌组（P＜0.001），提示DPC4的低表达可促进肺癌发生淋巴结转移。

    Folkman等认为“肿瘤是典型的血管依赖性病变”， 肿瘤新生血管是肿瘤生长、 侵袭和转移的重要条件。 肿瘤血管在输送营养物质的同时又成为携带癌细胞离开原发瘤形成转移瘤的工具和通道[6]， 因此对于肿瘤血管生成研究受到高度重视。 VEGF是一种多功能的细胞因子， 通过复杂的机制刺激血管内皮细胞增生诱导血管生成； 同时它可改变微血管内皮细胞的通透性， 促使血浆蛋白渗出到血管外间隙， 导致纤维蛋白原沉积， 为新生血管提供了基质和支持。 Irmard等在研究胰腺癌细胞株时发现， 在体内DPC4的重新表达抑制了肿瘤的形成， 更重要的是抑制了血管的形成， 减少了VEGF的表达而增加了血管形成抑制子血小板反应蛋白?1 (TSP?1)的表达。 DPC4抑制血管的形成可能是DPC4抑制肿瘤发生进展的另一机制， VEGF和TSP?1可能是DPC4的下游目的基因[7]。 本研究显示， DPC4阳性组中VEGF的阳性率、 MVD明显低于DPC4阴性组， DPC4的表达与VEGF的表达呈明显的负相关， 说明DPC4可通过调节VEGF的表达， 间接抑制血管的生成;  DPC4与MVD也呈明显负相关， 说明在NSCLC中DPC4还可直接或通过其他血管生成因子抑制血管生成。 本文的研究结果表明， DPC4一方面通过调节VEGF的表达， 间接抑制血管生成， 另一方面也可直接或通过其他血管生成因子抑制血管生成， 这提示DPC4和VEGF之间有拮抗作用。

    有研究者认为,DPC4的表达及过度表达,可使肿瘤细胞凋亡增加[8]。在我们的研究中,DPC4阳性组较DPC4阴性组凋亡指数显著增加，差异有显著性(Ｐ<0.05)。TGF?β1在细胞凋亡的启动过程中具有重要的作用[8]。TGF?βＲＩ和TGF?βＲⅡ通过上调促凋亡基因野生型p53的表达,下调突变型p53基因,使p53蛋白表达减少,最终抑制细胞生长周期向Ｇ1/Ｓ期过渡,导致细胞DNA损伤,引发细胞凋亡。而DPC4作为TGF?β信号通路中间的重要传导分子，其低表达会影响TGF?β促凋亡信号的传导，从而使凋亡细胞数降低。

    综上所述，本研究可得出如下结论，DPC4的低表达可通过直接或间接的作用促进肺癌血管生成和抑制凋亡的发生，从而促进肺癌的淋巴结转移。

【】
  ［1］ Hahn SA,Schutte M,Hoque AT,et al.DPC4,a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1.Science, 1996, 271(5247):350?353.

/[2/] Schwarte?Waldhoff I，Schmiegel W. Smad4 transcriptional pathw?ays and angiogenesis［J］. Int J Gastrointest Cancer,2002,31(1?3):47?59.

/[3/] Weidner N.Angiogenesis as a predictor of clinical outcome in cancer patients［J］. Human pathology,2000,31(4):403?405.

/[4/] Lin X,Liang M,Liang YY,et al.Activation of transforming growth factor?beta signaling by SUMO?1 modification of tumor suppressor Smad4/DPC4［J］. The Journal of biological chemistry,2003,278(21):18714?18719.

/[5/] Hahn SA,Bai RY,Koester C,et al.SMIF,a Smad4?interacting protein that functions as a co?activator in TGF beta signaling［J］. Nature cell biology,2002,4(3):181?190.

/[6/] Folkman J.Angiogenesis and proteins of the hemostatic system［J］. J Thromb Haemost, 2003,1(8):1681?1682.

/[7/]Schwarte?Waldhoff I , Volpert OV, Bouck NP, et al . Smad4/ DPC4 mediated tumor suppression through suppression of angiogenesis/[J/] . Proc Natl Acad Sci USA, 2000 ,97(17):9624?9629.

/[8/] 王春雷.黄志雄.周宇新. TGF?β1对人肝癌细胞系凋亡的调控作用研究.肿瘤防治研究［J］. 2004,31(9):526?528.