鼻NK/T细胞淋巴瘤的免疫表型、EBV感染及TCRγ基因重排的检测

             作者：刘繁荣，钟清玲，熊小亮，朱静，宋恩霖，温文

【摘要】  目的检测鼻NK/T细胞淋巴瘤（NK/TCL）的免疫表型、EBV感染及TCRγ基因重排，为诊断和鉴别诊断提供依据。 方法收集诊断鼻NK/TCL48例患者石蜡包埋标本，用免疫组化SP法标记LCA、CD79α、CD20、CD56、CD3、CD45RO及EBV抗体研究其免疫表型； EBER探针原位杂交方法检测EBV编码的小分子RNA（EBER）；聚合酶链式反应扩增方法检测TCRγ基因重排。结果48例鼻NK/TCL均表达LCA，CD3、CD45RO、CD56和EBV阳性率分别为44%、52%、73%和19%，CD79α和CD20均阴性；EBER阳性率为81% ；TCR γ基因重排阳性率为19%。结论鼻NK/TCL免疫表型不一致，并非所有病例CD56阳性，石蜡切片中CD3阳性定位于细胞质；EBER在肿瘤细胞中高表达，提示它们可能为NK细胞来源；部分TCR γ基因重排阳性病例应为鼻NK样T细胞淋巴瘤。

【关键词】  鼻NK/T细胞淋巴瘤；免疫组化；原位杂交；聚合酶链式反应

　　Immunophenotype and Epstein?Barr Virus Infection and Detection Rearrangement of T Cell Receptor γ(TCRγ) Gene in Nasal NK/T?cell Lymphoma

　　　Abstract：Objective To explore the immunophenotype and Epstein?Barr Virus(EBV) infection of nasal NK/T cell  lymphoma and the significance of detection rearrangement of   TCR  γ gene in diagnosis and differential diagnosis of nasal NK/T cell lymphoma. MethodsFouty?eight  cases of  nasal NK/T cell lymphoma were studied, immunophenotype was analyzed by immunohistochemical staining for LCA、CD79α、CD20、CD56、CD3、CD45RO and EBV with SP method. In situ hybridization (ISH) with EBER1/2RNA probes was perfomed.TCR  γ  gene rearrangement was analyzed by polymerase chain reaction(PCR) technique. ResultsAll the cases of nasal NK/T cell lymphoma were LCA positive.44% of the cases expressed CD3 with positive signal located in the cytoplasm, which was different from peripheral T cell lymphoma. 52% and 73% and 19% of the cases were CD45RO and CD56 and EBV respectively. EBER was dedected in 81% of the cases. The positive amplification of clonal TCR  γ  gene  in 9 out of 48 samples(19%) from nasal NK/T cell lymphoma. ConclusionThe immunophenotypes of nasal NK/T cell lymphoma showed less consistency. CD56 was not always positive of this tumor. The high frequency of EBER showed that these cells may have originated from NK cells．There is TCR  γ  gene support nasal NK?like T?cell lymphoma.

　　Key words：NK/T cell lymphoma; Immuneohistochemistry; In situ hybridization; Polymerase Chain Reaction

　　0引言

　　鼻NK/TCL是我国较常见的面中线部恶性肿瘤，以往诊断为中线恶性网状细胞增生症或多形性组织细胞增殖症，进一步被证实为鼻NK/TCL。但是，目前对鼻NK/TCL的免疫表型、EBV感染、肿瘤细胞来源等问题尚存在争议。本研究对48例鼻NK/TCL病例标本，采用多种方法，分析其免疫表型、EBV感染及TCR  γ基因重排情况，为其诊断和鉴别诊断提供依据。

　　1材料与方法

　　1.1病例收集选自医学院病教研室和附院病理科近年来鼻NK/TCL病例48例，另选取弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）11例和外周T细胞淋巴瘤（PTCL）8例作为对照，每例经2名以上淋巴瘤诊断经验丰富的病理专家复片确诊。所有病例均为石蜡包埋组织。

　　1.2免疫组织化学染色采用SP法, LCA、CD79α、CD20、CD56、CD3、CD45RO及EBV抗体和DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。取石蜡包埋组织3μm厚连续切片，常规脱蜡、水化，一抗4℃过夜，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗作阴性对照。细胞膜和(或)细胞质呈棕黄色颗粒为阳性。

　　1.3原位杂交因鼻NK/TCL与EBV感染有较高的相关性，我们进行了EBER原位杂交的检测。试剂盒购自福州泰普公司。石蜡切片蛋白酶K消化，用地高辛标记的EBV寡核苷酸探针杂交，DAB显色，苏木素复染。以已知EBER阳性的鼻咽癌为阳性对照，用TBS代替探针作阴性对照。细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。

　　1.4TCR  γ基因重排采用DNA纯化试剂盒(QIAGENE公司) 提取石蜡包埋组织的DNA，TCR γ通用引物TVG/TJX(GIBCOBRL公司)基因扩增，琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外光灯观察结果。用人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞株的DNA作阳性对照，以2例淋巴结反应性增生作阴性对照。PCR阳性判定标准[1]：带宽不超过1mm，边缘整齐, 条带在期望范围内。

　　2结果

　　2.17种抗体在48例鼻NK/TCL和19例对照组中的表达见表1。 所有检测的48例鼻NK/TCL和对照组19例淋巴瘤均表达LCA（100%）；21例（44%）表达CD3，阳性定位于细胞质，见图1。8例对照组外周T细胞淋巴瘤定位于细胞膜；CD56，见图2。CD45RO和EBV阳性例数分别为35例（73%）、25例（52%）和9例（19%）；所有检测的48例鼻NK/TCL 均不表达CD79α和CD20；对照组19例均不表达CD56和EBV。

　　2.2EBER原位杂交结果见表2。48例鼻NK/TCL中有39例（81%）为EBER阳性，阳性细胞分别占肿瘤细胞的30%～90%，阳性细胞呈簇状或弥漫型分布，未见反应性小淋巴细胞EBER阳性，见图3； 对照组19例淋巴瘤均EBER阴性。

　　2.3TCR?γ基因重排应用TVG/TJX引物对48例鼻NK/TCL和对照组进行PCR检测,结果显示：9例鼻NK/TCL和8例PTCL获得阳性产物，见图4；DLBCL均为阴性,电泳后无扩增条带出现。

　　表17种抗体在48例鼻NK/TCL和19例对照组中的表达（略）

　　表2EBER检测与组织类型的关系（略）
　　
　　M：标志分子量； 1：阳性对照；2：鼻NK/TCL；5、6、7、8、9：PTCL病例均见阳性条带；3：阴性对照；4：DLBCL均未见阳性条带

　　图4TVG/ TJX引物行TCR?γ基因扩增电泳图（略）

　　3讨论

　　鼻NK/TCL在我国显著高于欧美国家。但是，目前对鼻NK/TCL的免疫表型、EBV感染、肿瘤细胞来源等问题尚存在争议，肿瘤细胞既能表达T细胞表面标记物CD3、CD45RO等，也能表达NK细胞的表面标记物CD56，不能断定肿瘤细胞究竟来自T细胞或NK细胞[2]。本研究选用6种淋巴瘤常用标记物对48例鼻NK/TCL进行检测，结果显示肿瘤细胞不表达B细胞标记物CD79α和CD20；CD45RO的阳性率为52%,与报道相似[3]。48例鼻NK/TCL 的CD3阳性率为44%，阳性反应位于细胞质，而对照组8例PTCL的CD3阳性率为100%，且阳性反应位于细胞膜，与文献报道一致[4]。故阳性定位的差别也有助于鼻NK/TCL和PTCL的鉴别。本组48例病变的CD56阳性率为73%，符合Jaffe 等[2]检测的CD56在鼻NK/TCL中阳性率大于70%的报道。尽管CD56是目前认定的NK细胞表面标记物，但是我们的研究结果表明并非所有的鼻NK/TCL都表达CD56。13例CD56阴性的病例中，4例CD3阳性定位在胞质，符合鼻NK/TCL的表现；对其余9例CD56和CD3均阴性的病例再次复片，均能找到诊断鼻NK/TCL的形态学特征，临床特点也符合诊断。在48例鼻NK/TCL中，EBV免疫表型和EBER检出率分别为19%和81%，所有EBV免疫表型阳性的病例EBER均阳性，说明鼻NK/TCL中EBV原位杂交检测优于免疫组化，故原位杂交检测EBER可作为鼻NK/TCL重要的辅助诊断，与文献报道相似[5]。本研究中，9例TCR  γ基因重排阳性，说明鼻NK/TCL中存在T细胞的单克隆性增生，但基因重排率较文献[6]报道94.45%低，可能与其采用TCR γ特异性引物有关；同时 CD56均阳性，且单纯NK细胞系不出现TCR基因重排，说明鼻NK/TCL瘤细胞可同时来源于NK细胞和T细胞，与Chiang AKS的观点一致[7]，故该部分病例应称之为NK样T细胞淋巴瘤。总之，鼻NK/TCL的免疫表型比较多样，对于CD56阳性的病例，结合EBER原位杂交检测和TCR γ基因重排能正确诊断；而对于CD56阴性病例的诊断需结合临床表现和组织形态特点。

　【文献】
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　　[2]Jaffe ES，Chan JKC，Su IJ，et a1．Report of workshop on nasal and related extranodal angiocentric T／Natural killer cell lymphoma：definitions，differential diagnosis and epidermiology[J].Am J Surg Pathol，1996，20(1)：103?111．

　　[3]盛伟琪，陆洪芬，李小秋，等. 鼻NK／T细胞淋巴瘤的免疫表型和细胞毒颗粒蛋白的表达及其意义[J].癌症杂志,2004,14(2):135?138.

　　[4]Chan JKC， Tsang WYW， Ng CS, et a1． Discordance CD3 expression in lymphomas when studied on frozen and paraffin sections [J]．Hum Pathol，1995，26(10)：1139?1143．

　　[5]钟博南，张晓华，李敏，等. NK／T细胞淋巴瘤的病理组织学、免疫表型及基因研究[J]. 中华血液学杂志，2003，24（10）:505?509.

　　[6]陈德忠，刘卫平，刘永惠，等.中线T细胞淋巴瘤的TCRγ基因重排研究[J].中华病杂志,1998,27(3):198?201.

　　[7]Chiang AKS，Srivastava G，Lau PWF，et al．Differences T?cell?receptor gene rearrangement and transcription in nasal lymphomas natural killer and T?cell type [J]．Hum Pathol，1996，27(7)：2137?2140．