电融合法制备骨肉瘤融合细胞瘤苗的特性分析

【摘要】  　　目的 本研究旨在制备骨肉瘤融合细胞瘤苗并检测其体外生物学特性。方法 应用电融合技术制备UMR?106细胞与大鼠巨噬细胞的融合细胞，经过磁性分选后，流式细胞仪检测融合细胞的DNA含量和表面抗原的表达。细胞培养检测融合细胞的克隆形成能力，并体外测定其诱导CTL的杀伤活性。结果 电融合与磁性分选技术相结合可获得95%的融合细胞纯度。流式细胞仪测定表明，融合细胞可表达较高的MHC?Ⅰ、Ⅱ类抗原。其软琼脂克隆形成能力明显降低（UMR?106,29.2±7.2,融合细胞，17.6±5.1,P＜0.05）,而诱导CTL细胞杀伤的能力则显著提高（100∶1时UMR?106 13.4±3.2，融合细胞 42.9±7.5,P＜0.05）。结论 骨肉瘤融合细胞可稳定生长，在体内诱导CTL细胞产生较强的抗肿瘤活性，可用于动物模型以检测其所诱导的抗骨肉瘤效果。

【关键词】  骨肉瘤　瘤苗　细胞融合

　　Characterization of  Osteosarcoma  Vaccine  Cells  Prepared  by  Electrical  Cell  Fusion

　　Abstract：Objective   Prepare  the  osteosarcoma  vaccine by cell fusion and  detect  itsbiological properties.Methods  The  osteosarcoma  vaccine  was  obtained  by  fusing  UMR?106  and  rat  macrophages  with  electorporator.The  DNA  and  surface  antigen  expression  of  fusion cells  purified  by  magnetic  cell  sorting  unit  were  assayed  with  flowcytometry.The  colony  assay  of  the  cells  and  the  analysis of  CTL  activity  induced  by  fusion  cells  in vivo  were  also  performed.Results  The higher  cell  fusion  efficiency  can  be obtained  with  electroporator  and   about  95%  purity of  fusion  cells  achieved  by  magnetic  cells  sorting  unit. The  fused  osteosarcoma  cells  expressed  more  MCH?Ⅰ、Ⅱ and formed  less  colony  on  soft  arga.Those  cell  intensively  induced  the  CTL  activity  against  wild  UMR?106 cells  as  well.Conclusion  The proliferation  of  fused  osteosarcoma  cells  was  stable  and  the  high  level  CTL  activity  was   induced  by  them.The  cells  can  be used  as  vaccine  in  osteosarcoma  treatment  evaluation  on  animal  models.

　　Key words：Osteosarcoma; Tumor  vaccine; Cell  fusion

　　0  引言
   
　　复发和肺转移是威胁骨肉瘤患者生命的主要矛盾［1］,为此，有必要探讨主动性免疫在骨肉瘤患者中应用的可能性。由于尚未发现明确的骨肉瘤特异性抗原，因此将经过修饰的骨肉瘤细胞作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的治疗途径值得探讨［2］。
   
　　本研究应用电融合技术制备骨肉瘤与抗原提呈细胞（主要是巨噬细胞，树突状细胞研究另文报告）的融合细胞，并对其相关的免疫学特性加以研究，为其作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤患者的治疗提供理论指导。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验材料及仪器
   
　　大鼠骨肉瘤细胞系UMR?106购自美国ATCC（American  Tissue Culture Collection）;大鼠MHC?Ⅰ、Ⅱ单抗，大鼠巨噬细胞CD68单抗，羊抗小鼠IgG?FITC均为英国SEROTEC公司出品；RPMI?1640培养基和胎牛血清为Invitrogen公司生产，3H?TdR为上海原子能研究所产品。SD大鼠购自第四军医大学实验动物中心，雄性个体5只，平均体重136克。ECM2001型细胞融合仪购自美国BTX公司；MACS磁分选仪和试剂盒由德国Miltenyi  Biotec  GmbH生产。

　　1.2  细胞培养
   
　　肿瘤细胞和融合细胞均培养在含10%胎牛血清的RPMI?1640培养基中，0.25%胰蛋白酶消化传代。

　　1.3  巨噬细胞分离
   
　　拉颈处死成年SD大鼠，全身70%乙醇灭菌后在超净台中剪开腹腔，用滴管加入10ml RPMI?1640不完全培养基灌洗，小心吸出培养基1 000r/min,离心5min收集巨噬细胞，培养在含10%胎牛血清的RPMI?1640培养基中。

　　1.4  细胞融合
   
　　应用细胞融合仪按1∶5融合巨噬细胞和UMR?106细胞。使用3.2mm融合电极，AC为30 V 10s;DC为640 V  30μs;2个脉冲。其他操作参见仪器说明书。

　　1.5  融合细胞的筛选和分离效果检测
   
　　应用MACS磁性分选仪和MS+分选柱，按CD68单抗分选试剂盒使用说明操作，分离出CD68+细胞。分选出的细胞做连续传代排除未融合的巨噬细胞，获得相对较纯的融合细胞（MUFs）。
   
　　将上柱前的细胞、CD68结合细胞和未结合细胞各1×105个，用PBS洗1次并悬浮在80μl  PBS中，加入20μl  FITC标记的羊抗鼠IgG,孵育10min后PBS洗2次，在400倍荧光显微镜共计数200个细胞（四个视野），根据公式回收率和纯度［3］。
   
　　回收率=100×(N1×P1)/(N0×P0),其中N1为洗脱段的细胞数，P1为洗脱段阳性细胞百分率，N0为上柱前细胞总数，P0为上柱前阳性细胞百分率。

　　1.6  DNA含量测定和染色体计数
   
　　1×105个融合细胞悬浮在200μl   PBS中加EB染色10min,流式细胞仪测定细胞DNA含量。培养的融合细胞生长至80%满时加秋水仙碱到终浓度为0.25μg/ml处理3h,胰酶消化后加0.075mol/L  KCL低渗处理细胞25min,然后用甲醇/冰醋酸（3∶1）固定2次，制片后染色拍照。

　　1.7  细胞表面抗原的表达
   
　　1×105融合细胞悬浮在80μl   PBS中，分别加入MHC?Ⅰ、Ⅱ和CD68各20μl ，4℃孵育10min,PBS洗2次，加入FITC标记的二抗20μl，4℃孵育10min,PBS洗2次，重悬在200μl   PBS中上流式细胞仪检测。

　　1.8  克隆形成率和软琼脂克隆形成能力
   
　　按300/孔把融合细胞接种在24孔板中，10天后计数已形成的克隆数，大于30个细胞的集落算1个克隆。按公式计算克隆形成率，克隆形成率=克隆数/接种细胞数。
   
　　将0.6%底层琼脂加入24孔板中，每孔1ml，待其凝固后调整细胞浓度2×103/ml，并在37℃与0.4%琼脂混合，按每孔500个细胞的量加到底层琼脂上，37℃培养2周后计数克隆数。

　　1.9  体内诱导杀伤性T淋巴细胞的能力
   
　　分别用融合细胞和UMR?106细胞接种SD大鼠，2周后取脾。制备脾细胞悬液，加0.83%氯化铵去除红细胞，然后用尼龙毛柱去除B淋巴细胞。与免疫大鼠时相对应，在2×106个T淋巴细胞中分别加入1×105个经3 000rad  60 Co灭活的融合细胞和UMR?106细胞，孵育3天，作为效应细胞。在2×106个UMR?106细胞中加入20μCi3H?TdR，37℃孵育3h作为靶细胞，按5×103/孔加入96孔板中。按25∶1、50∶1和100∶1将效应细胞加到靶细胞中，各3个复孔，混合后置37℃孵育18h。细胞收集仪收集细胞后在液闪计数仪上测定每分钟计数（cpm）,用公式［(1?实验组cpm)/对照组cpm］计算CTL杀伤活性。以上实验共重复3次。

　　1.10  统计学方法
   
　　数据经SPSS软件做统计学分析。

　　2  结果

　　2.1  融合细胞磁性分选的效率
   
　　通过电穿孔仪融合的细胞用磁性分选仪加以纯化，结果表明磁性分选对阳性细胞的回收效率为84.2%，纯化后阳性细胞的纯度为95.6%。

　　2.2  融合细胞的DNA含量和染色体分析
   
　　UMR?106细胞和融合细胞的DNA含量检测结果如图1所示，融合细胞DNA含量明显增加。

　　图1  细胞DNA含量检测（略）

　　A：UMR?106;B： 融合细胞

　　染色体分析表明，UMR?106细胞干系染色体数目为87～97条，呈4倍体；融合细胞干系染色体数目为128～141条，与DNA分析结果相一致。

　　2.3  融合细胞表面抗原表达的检测结果
   
　　巨噬细胞的几种表面分子表达均较高。UMR?106细胞的MHC?Ⅰ表达率为70.8%,融合后提高到83.6%。UMR?106细胞检测不到MHC?Ⅱ的表达，融合后的MHC?Ⅱ表达率提高到22.4%。融合细胞CD68的阳性率与巨噬细胞类似。

　　2.4  软琼脂克隆形成能力
   
　　融合细胞MUFs的克隆形成率略有下降，但统计学分析无显著性差异。融合细胞MUFs在软琼脂中的克隆形成能力显著降低，与UMR?106细胞的差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

　　表1  两种细胞形成克隆的能力（略）

　　注：*P＜0.05  vs  UMR?106

　　2.5  体内诱导CTL杀伤活性的测定
   
　　融合细胞MUFs诱导CTL杀伤活性的能力明显强于对照组，尤其在效靶比为100∶1时的作用更明显，见图2。

　　图2  体内诱导CTL杀伤活性的能力（略）

　　3  讨论
   
　　本研究尝试通过与巨噬细胞相融合对骨肉瘤细胞加以修饰，目的是希望能提高骨肉瘤细胞抗原的免疫性并能够以适当的方式提供给T淋巴细胞而激活免疫系统，从而诱导出相应的抗肿瘤免疫效应。
   
　　我们首先将大鼠UMR?106细胞与同基因型的巨噬细胞相融合。由于采用电融合技术，与其他作者报告的PEG融合方法相比［4］,融合效率提高一倍以上，为下一步的快速筛选提供了条件。
   
　　作为用于免疫的抗原，融合细胞筛选是影响治疗效果的关键因素。由于融合的细胞双方都不带选择标记，因此无法用药物加压筛选，而采用传统的无限稀释克隆筛选法十分耗时。我们选用磁性分离技术取得了非常好的效果，回收率和纯度分别达到84%和95%，大大加快了实验进度。
   
　　染色体分析显示，融合前UMR?106细胞干系染色体为87～97条，基本上为4倍体，而融合细胞的干系染色体为128～141条。流式细胞仪的DNA分析表明，融合细胞的DNA含量较UMR?106细胞明显增多，与染色体分析结果相一致，表明电穿孔融合法建立的融合细胞经磁性分选及连续传代后可在体外稳定培养，为融合细胞瘤苗治疗提供了保障。
   
　　从细胞抗原的表达方面看，融合细胞在MHC?Ⅰ、Ⅱ类分子和CD68的表达均较UMR?106细胞明显增加。目前认为，肿瘤主要激活MHC?Ⅰ类分子限制的CD8+T淋巴细胞，同时MHC?Ⅱ类分子限制的CD4+T细胞的活化对维持CTL的杀伤活性和免疫记忆都具有十分重要的意义［5］。因此，这些免疫分子在融合细胞的表达增加，有可能使融合细胞本身具有一定的抗原提呈作用［6］，从而更有效地激活免疫系统。
   
　　具有恶性生长特性的骨肉瘤细胞与正常的巨噬细胞融合以后，生物学特性也发生了显著变化。克隆形成率虽无显著变化，但克隆生长形态有显著差别，融合细胞克隆集落呈自限性生长，而融合前肿瘤细胞则呈扩张性生长，其具体原因还有待于研究。另外软琼脂克隆形成数明显减少，说明骨肉瘤细胞与正常抗原提呈细胞融合后恶性程度可能有所降低。
   
　　用融合细胞免疫的大鼠，其T淋巴细胞显示特异性的活化。在体外将T细胞与UMR?106细胞共同培养时，融合细胞组的T淋巴细胞活性显著强于对照组（P＜0.05）。将标记了3H的UMR?106细胞作为靶细胞时，融合细胞的CTL杀伤活性也较对照明显增强。融合细胞的这种激活免疫系统的能力很可能与其表面分子如MHC?Ⅰ、Ⅱ等的表达增加有关，在抗原提呈细胞处理肿瘤抗原并形成免疫复合物以后，能更有效地呈递给T淋巴细胞并进而分别激活CD4+T和CD8+T淋巴细胞。
   
　　在此基础上，我们将融合细胞用于动物实验，结果表明，可显著延长荷瘤大鼠的生存时间并降低肺转移的发生率［7］。

【】
  　　［1］ Bacci G,Lari S. Current treatment of high grade osteosarcoma of the extremity:review［J］.J Chemother, 2001,13(3):235?243.

　　［2］ Jantscheff P,Spagnoli G, Zajac P, et al.Cell fusion: an approach to generating constitutively proliferating human tumor antigen?presenting cells［J］.Cancer Immunol Immunother, 2002,51(7):367?375.

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　　［4］ Lindner M, Schirrmacher V.Tumor cell?dendritic cell fusion for cancer immunotherapy:comparison of therapeutic efficiency of polyethylen?glycol versus eletro?fusion protocols［J］. Eur J Clin Invest,2002,32(3):207?217.

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　　［6］ Ostrand?Rosenberg S.Tumor immunotherapy:the tumor cell as an antigen?presenting cell［J］.Curr Opin Immunol, 1994,6(5):722?727.

　　［7］ 郝新保，范清宇.SEA及MDP对骨肉瘤融合细胞瘤苗作用的影响［J］.肿瘤防治研究,2005，32（5），302?304.