可调控重组腺相关病毒对MCF?7细胞基因转染效率及表达的研究
作者：王燕燕，宋兴福，崔向军，黄骥
【摘要】 目的研究青蒿琥酯(artesunate,Art)体外诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及对半胱天冬氨酸蛋白酶9(cysteine containing aspartate9,caspase?9)和caspase?3活性的影响。方法Art处理A549细胞，流式细胞计数(Flow Cytometry,FCM)检测细胞周期和细胞凋亡，比色法检测caspase?9活性，western blot检测caspase?3变化。结果FCM显示A549细胞经100mg/L Art作用24h，出现S期细胞减少(P<0.01)，G2/M期细胞数目增多(P<0.01)，细胞凋亡率增加(P<0.0)。不同浓度（10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L）的Art作用A549细胞24h，caspase?9活性呈浓度依赖性增加，分别为对照组的9.87倍、23.33倍（P<0.01）、38.47倍（P<0.01）和60.47倍（P<0.01）。Western blot 显示A549细胞经100mg/L Art作用6、12、24h后，细胞浆中caspase?3活化，分别为对照组1.2倍、1.6倍(P<0.01)、1.8倍(P<0.01)。结论青蒿琥酯可通过增加caspase?9和caspase?3的活性，诱导A549细胞凋亡，为阐明Art的抗癌机理，指导青蒿琥酯用于肿瘤提供实验依据。
【关键词】 青蒿琥酯；A549细胞；细胞凋亡；caspase?9；caspase?3
Abstract：Objective To investigate the effects of artesunate on apoptosis of human adenocarcinoma cell line A549 cells and activation of cysteine containing aspartate 9(caspase?9) and cysteine containing aspartate 3(caspase?3). MethodsA549 cells were treated with artesunate, cell cycle phase's distribution and apoptosis were detected by flow cytometry. Activation of caspase?9 was identified by colorimetric assay. Change of caspase?3 was detected by western blot. ResultsWith artesunate treatment, marked cell accumulation in G2/M phase was observed after 100mg/L Art exposure for 24h. In addition, the percentage of apoptosis increased, from (3.5±0.7)% in control cultures to approximately （19.4±1.5）% after 100mg/L Art treated for 24h. caspase?9 colorimetric assay showed basal levels of caspase?9 activity in A549 cells, and after Art treatment, caspase?9 activity increased in a dose?dependent manner. After A549 cells treated with 100mg/L Art for 6h, 12h and 24h, the activity of caspase?3 increased with fold of 1.2, 1.6(P<0.01) and 1.8 (P<0.01), respectively. ConclusionArt is of strong anticancer effect which is associated with activation of caspase?9 and caspase?3 specific pathway.
Key words：Artesunate; A549 cells;Apoptosis;caspase?9;caspase?3
0引言
青蒿素及其衍生物是我国自主知识产权的高效抗疟药。近年来的研究发现青蒿素及其衍生物除了具有抗疟作用以外，对人类多种肿瘤细胞在体外有杀伤作用或抑制作用[1?5]，但其作用机制尚不十分清楚。为了探讨青蒿素的衍生物之一青蒿琥酯(Artesunate,Art)的抗癌机制，我们采用Art诱导人肺腺癌A549细胞凋亡，并检测caspase?9和caspase?3活性变化，结果表明，Art可使A549细胞中caspase?9和caspase?3的活性明显增加，现报道如下：
1材料与方法
1.1主要试剂及仪器Art，桂林南药股份有限公司，批号050201；1640培养基（RPMI medium 1640）和胰蛋白酶，Gibco公司；胎牛血清（Fetal calf serum,FCS），杭州四季青公司；碘化丙啶（PI）,Sigma公司；caspase?9 colorimetric assay kit，Calbiochem公司；ECL kit，Kirkegaard Perry Laboratories公司；兔多克隆抗caspase?3抗体（H?277,sc?7148,可识别caspase?3酶原和p11、p17、p20 caspase?3）和β?actin(C?2,sc?8432)均为Santa Cruz产品；丙烯酰胺、N，N甲叉丙烯酰胺、SDS、Tris?cl、牛血清白蛋白（BSA）、硝酸纤维素膜（NC膜）、考马斯亮兰R?250、过硫酸胺（AP）均为Amersco产品。酶标仪(GENios VA200)，奥地利TECAN公司；流式细胞仪（EPICS ALTRA II），美国Beckman公司；凝胶成像系统(Bio?ID)，法国VL公司。
1.2细胞培养人肺腺癌细胞株A549,购自武汉大学典藏物保存中心，接种于含10% FCS的RPMI1640培养液中，置37℃、5% CO2孵箱中常规培养，每2～3d传代1次。
1.3流式细胞计数（Flow Cytometry, FCM）检测细胞周期和凋亡100mg/L Art处理细胞，24h后收集细胞，用冷PBS（0.01M pH 7.4）漂洗，滴加80%乙醇-20℃固定过夜。RNA酶(1mg/ml)37℃孵育30min，冰上2min，PI综合染液（含100mg/L PI、0.1% TritonX?100）暗处孵育30min。上机前用孔径40μm的尼龙网过滤。细胞周期统计及凋亡分析采用数据获取软件CELLQuest及DNA分析软件ModFit LT。
1.4检测caspase?9活性A549细胞分别暴露于不同浓度（10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L）的Art，24h后采用比色法检测细胞浆中caspase?9活性。检测方法参照caspase?9 colorimetric assay kit说明书，简述如下：先采用终浓度分别为0、50、100、200和400mg/L标准物的吸光度绘制标准曲线。收集5×106细胞，加入50μl预冷的细胞裂解液，冰上孵育10min，4℃、10000×g离心1min，收集上清液为细胞抽提物，蛋白浓度。96孔板中加入用缓冲液稀释的蛋白样本50μl、2×反应缓冲液（含10mM DTT）50μl、4mM LEHD?pNA底物5μl，37℃孵育1h，酶标仪上读取405nm波长处的吸光度值（A值），caspase?9活性单位(U)=(各组A值-凋零组A值)/标准曲线斜率，每组重复4孔。
1.5Western blot检测细胞浆caspase?3蛋白A549细胞暴露于100mg/L Art，分别在6、12、24h后按方法[6]提取总蛋白，SDS?PAGE 电泳后，依次进行凝胶转膜、封闭、一抗和二抗杂交、ECL显色、X光片曝光，依据目标蛋白条带的灰度判断表达情况。
1.6统计学分析实验数据用均数±标准差(±s)表示，均数间比较采用单因素方差分析，均在SPSS13.0软件上完成，显著性检验为P<0.05。
2结果
2.1Art诱导细胞凋亡表1显示，Art可以抑制A549细胞的DNA合成、诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡。
表1100mg/L Art作用A549细胞24h对细胞周期和细胞凋亡影响（略）
2.2Art对caspase?9活性的影响表2显示Art诱导A549细胞浆的caspase?9活性增强,呈浓度依赖性。
表2Art对A549细胞浆中caspase?9活性的影响（略）
2.3Art对caspase?3蛋白的影响细胞凋亡时，细胞浆中pro caspase?3分解产生p11、p17、p20 caspase?3，可经Western blot检测。在本实验中，A549细胞经100mg/L Art作用6、12、24h后，细胞浆中caspase?3出现32kDa和17kDa条带，经密度灰度扫描定量分析，6、12、24h的caspase?3分别为对照组1.2倍、1.6倍(P<0.01)、1.8倍(P<0.01)，见图1。
3讨论
青蒿素是从菊科植物黄花蒿中提取的有效单体，是一种新的化学结构抗疟药，因其抗疟效果突出，毒副作用小，广泛用于疟疾的临床抢救和。
与对照组比较, **P<0.01
图1 100mg/L Art 对A549细胞caspase?3活化的影响（略）
自90年代以来，陆续有研究发现青蒿素除了有抗疟作用之外，还具有很强的抗肿瘤作用。如孙玮辰等[7]1992年首先报道了青篙酸和青篙B的衍生物，在体外对小鼠白血病细胞P388、人肝癌细胞SMMC?7721和人胃癌细胞SGC7901的生长有较强的抑制作用。1993年，Woerdenbag HJ等[8]报道青篙素及其衍生物对艾氏腹水癌细胞有较强的抑制作用。杨小平等[9]报道Art对低分化麟状上皮癌CNE2和SUNS?1和Hela细胞具有明显的杀伤作用，体内实验表明静脉注射Art 50mg/kg和100mg/kg，对荷S180肉瘤小鼠的抑瘤率分别为24%～29%和34%～53%。Art在100、180和324mg/（kg·d）剂量时，对裸鼠异体移植人肝癌细胞BEL?7402有明显的抑制作用，抑瘤率分别为44%、49%和71%[10]。本实验结果也显示，100mg/L Art作用A549细胞24h可以抑制DNA合成、诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡。肿瘤细胞凋亡机制的深入研究表明，线粒体的跨膜电位下降，会引起线粒体膜上的通透性转运孔（Permeability transition pore,PTP）异常开放，随而引起线粒体膜电位的进一步下降甚至消失、线粒体的膨胀以及外膜的破裂，进而细胞色素C、凋亡诱导因子（Apoptosis inducing factor,AIF）及其他一些因子会通过PTP或破裂的外膜直接泄漏出来，促使caspases蛋白酶的级联激活从而诱发细胞凋亡[11,12]。为了探讨Art是否可经过内源性线粒体途径引起caspases的级联反应诱导细胞凋亡，本实验将A549细胞暴露于不同浓度的Art，24h后采用比色法检测细胞浆中caspase?9活性，结果显示caspase?9的活性增加，并呈浓度依赖性效应。此外，我们也采用Western blot检测A549细胞暴露于100mg/L Art后6、12、24h的细胞浆中caspase?3的变化，结果显示随Art作用时间延长，细胞内procaspase?3酶原降解，caspase?3激活，呈时间依赖效应。从以上研究结果，我们推断Art可引起线粒体膜电位下降，细胞色素C释放，进而依次激活caspase?9、caspase?3，引起PARP的降解，最终引起细胞核DNA片段化等一系列凋亡反应的发生而诱导A549细胞凋亡。但细胞凋亡的途径众多，除了以上内源性的线粒体途径之外，是否还有其他的途径参与了Art诱导的细胞凋亡，比如FADD通路等，尚需进一步的研究。综上所述，本实验表明Art可通过激活caspase?9、caspase?3级联的线粒体依赖性途径诱导A549细胞凋亡。本研究结果为阐明Art的抗癌机制，指导Art用于肿瘤化疗提供实验依据。
【】
［1］Dell'Eva R，Pfeffer U，Vené R，et al．Inhibition of angiogenesis in vivo and growth of Kaposi's sarcoma xenograft tumors by the anti?malarial artesunate[J]．Biochem Pharmacol，2004，68(12)：2359?2366．
[2]Efferth T，Benakis A，Romero MR，et al．Enhancement of cytotoxicity of artemisinins toward cancer cells by ferrous iron[J]．Free Radic Biol Med，2004，37(7)：998?1009．
[3]Rinner B，Siegl V，Purstner P，et al．Activity of novel plant extracts against medullary thyroid carcinoma cells[J]．Anticancer Res，2004，24(2A)：495?500．
[4]林芳，钱之玉，薛红卫，等．青蒿素和青蒿琥酯对人乳腺癌MCF?7细胞的体外抑制作用比较研究[J]．中草药，2003，34(4)：347?349．
[5]李哲，袁守军，聂丽平．青蒿琥酯诱导肿瘤细胞凋亡与抑制存活蛋白表达有关[J]．临床药与治疗学，2004，9(6)：607?611．
[6]颜子颖，王海林译．精编分子生物学实验指南[M]．北京：出版社，1998.333?373．
[7]孙玮辰，韩家娴，杨蔚怡，等．四种青篙酸及青篙B衍生物的体外抗癌作用[J]．中国药理学报，1992，13(6)：541?543．
[8]Woerdenbag HJ，Moskal TA，Pras N，et al．Cytotoxicity of artemisinin?related endoperoxides to Ehrlich ascites tumor cells[J]．J Nat Prod，1993，56(6)：849?８55．
[9]杨小平，潘启超，梁永拒，等．青蒿琥酯的抗肿瘤作用[J]．癌症，1997，16(3)：186?189．
[10]张星，杨小平，潘启超．青蒿琥酯抗人肝癌(BEL7402)与诱导凋亡[J]．中草药，1998，29(7)：467?469．
[11]Gottlieb RA．Mitochondria：execution central[J]．FEBS Lett，2000，482(1?2)：6?12．
[12]Tang L，Zhang Y，Jobson HE，et al．Potent activation of mitochondria?mediated apoptosis and arrest in S and M phases of cancer cells by a broccoli sprout extract[J]．Mol Cancer Ther，2006，5(4)：935?944．
