全人源食管癌单链抗体scFv基因文库的构建

            作者：段红 唐树彬, 庞华, 彭志平, 李少林

【摘要】  目的制备全人源化食管癌单链抗体scFv基因文库。方法取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源，提取总RNA，用RT?PCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对，以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段，再以它们为模板分别扩增VH?linker与VL?linker，用SOE?PCR技术将它们拼接成scFv,再引入酶切位点Sfi I和Not I，胶回收PCR产物获得scFv。将scFv基因克隆入噬菌粒载体 pCANTAB?5E后电转入Ecoli TG1。PCR法鉴定抗体基因插入率，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物。结果食管癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带；VH基因的大小约为450bp,VL基因为350bp,组装后的scFv基因约为850bp。PCR连接产物的转化效率为2×107cfu/μg，scFv的阳性插入率为91.7％(22／24)。结论食管癌相关的人源单链抗体基因文库的构建为进一步筛选单链抗体库奠定了基础。

【关键词】  噬菌体抗体库；单链抗体；食管癌；基因工程抗体

    1材料和方法

    1.1材料总RNA抽提试剂盒（W6701）购自上海华舜生物工程有限公司、cDNA合成试剂盒RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0购自大连宝生物工程有限公司、DNA100bp Marker购自上海生工生物工程技术服务有限公司, DNA纯化试剂盒 (W5211) 购自上海华舜生物工程有限公司、Sfi I和Not I内切酶、T4 DNA连接酶、TaKaRa Ex TaqTM HS均购于大连宝生物公司；载体pCANTAB? 5E和大肠杆菌TG1均购自Amersham Biosciences公司。

    1.2方法

    1.2.1淋巴结总RNA的提取食管癌病人（重庆医科大学临床学院胸外科食管癌病人10例，手术后经病理确诊鳞癌6例， 腺癌4例）手术时取癌肿周围淋巴结，无菌生理盐水漂洗后，剪成约0.3cm大小的组织块，立即放入盛有液氮的冰瓶中，取回后立即进行总RNA的提取或放入液氮中保存。淋巴结的裂解及RNA的纯化按试剂盒说明操作，将获得的RNA（鳞癌和腺癌的RNA混匀后）贮存于-70℃。琼脂糖电泳判断RNA的完整性，分光光度仪测A260/A280判断RNA的纯度。  

    1.2.2确定扩增VH和VL基因引物对引物序列中的简并符号采用IUPAC命名方式：R=A或G; W=A或T; K=G或T; Y=C或T; S=G或C; H=A或C或T; N=A或C或G或T，引物参照[1,2] 设计,引物委托北京三博远志生物技术有限责任公司合成，为PAGE纯化产品。引物浓度的：PCR反应中引物工作浓度为0.2μM。

    1.2.3网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对IgG特异VH和VL基因片段扩增：用扩增重链可变区和扩增轻链可变区的每一个后引物和每个前引物交叉配对（网格筛选）做PCR,然后分别将PCR产物电泳，确定扩增VH和VL基因片段的引物对。扩增重链可变区引物对：HuJH3FOR：5’?TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC?3’HuVH5aBACK：5’?GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC?3’扩增轻链可变区引物对：HuJк2FOR：5’?ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC?3’HuVк5aBACK：5’?GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC?3’扩增VH?linker引物对： HuJH4?5Linker：5’?AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCC

    TCCACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC?3’    HuVH5aBACK：5’?GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC?3’扩增VL?linker的引物对：HuJ к2FOR: 5’?ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT C

    CC?3’Linker?HuVк2?3?6BACK：5’?GTTCAGGCGGAGGTGGC

    TCTGGCGGTGGCGGATCGGAWRTTGTGHTGACKCAGTC

    TCC?3’引入酶切位点的引物：HuVH5aBACKSfi：    5’?GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGC

    CGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC?3’HuJк2FORNot：5’?GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGC

    ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC?3’

    1.2.4RT?PCR逆转录反应（cDNA第一链的合成）A①按下列组成配制反转录反应液：MgCl2 2μl，10×RT Buffer 1μl，RNase Free dH2O 2.75μl，  dNTP Mixture(10mM each) 1μl，RNase Inhibitor 0.25μl，Oligo dT –Adaptor Primer 0.5μl，RNA 2μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5μl，总量10μl。②按以下条件进行反转录反应：42℃ 20 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min 1个循环。

    1.2.5VH和VL基因扩增用确定好的引物对分别在PCR仪上扩增VH和VL基因片段。PCR反应B①按下列组成配制PCR反应液：重链可变区和轻链可变区分别进行：5×PCR Buffer 10μl，灭菌蒸馏水27.75μl，Back primer  1μl，Forward primer  1μl，TaKaRa Ex TaqTM HS 0.25μl，总量40μl。②把B?①的反应液加入到A?②的反转录反应结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。③按以下条件进行PCR反应：94℃，2 min  1个循环，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1  min， 30个循环。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳（1.5％）纯化回收VH和VL基因片段。

    1.2.6scFv基因的组装VH和VL基因片段延伸连接肽VH?linker和VL?linker:  用上述纯化的VH和VL基因片段作为它们延伸连接肽的模板，用相对应的人JH?linker primers和 human VH back primers扩增VH?linker，用相对应的linker?human Vк primers和human Jк forward primers扩增VL?linker。SOE?PCR(剪切重叠延伸PCR, splicing  overlapping extend－PCR)[3]：将上述扩增的VH?linker和VL?linker的PCR产物在无引物情况下用SOE?PCR连接：首先变性步骤94℃ 5  min，94℃ 1 min, 60℃ 1  min，72℃ 1.5 min，5个循环，然后加入含酶切位点引物，94℃ 30 s, 60℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30个循环，胶纯化回收scFv。

    1.2.7单链抗体基因文库的建立[4]单链抗体基因先后用限制性内切酶Sfi I和Not I酶切过夜，产物纯化后，与同样酶切后的噬菌体载体pCANTAB?5E 进行连接反应，连接产物纯化后，电转化大肠杆菌TG1,涂SOBAG平板，同时用pUC18标准质粒测定转化效率，在含2％葡萄糖和100μg／ml的SOB培养基上30℃培养过夜。

    1.2.8PCR法鉴定抗体基因插入率挑取24个细菌集落，加入3  ml含氨苄青霉素100  mg／ml 的LB培养过夜。按质粒提取试剂盒说明提取质粒，取2 μl为模板采用50μl体系，进行PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测scFv的阳性插入率。

    1.2.9阳性克隆酶切鉴定PCR反应阳性的质粒用Sfi I和Not I双酶切，产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。

    2结果

    2.1淋巴结总RNA的提取食管癌患者淋巴结总RNA用1.5%琼脂糖电泳判断RNA的完整性，可见两条带18S与28S, 而且28S条带的亮度是18S的两倍。分光光度仪测A260/A280判断RNA的纯度>1.8。

    2.2VH和VL基因扩增产物的鉴定VH和VL基因扩增后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，VH基因的大小约为450  bp, VL基因为350 bp，见图1。

    2.3scFv基因的组装  scFv基因组装后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳证实，组装后的scFv基因约为850  bp，见图2。

    2.4PCR连接产物的转化效率的测定pUC18标准质粒测定大肠杆菌TG1转化效率为108 cfu/μg，PCR连接产物的转化效率为2×107 cfu/μg。

    2.5PCR法鉴定抗体基因插入率PCR法检测24个菌落，22个克降扩增出scFv，目的基因插入率为91.7%，见图3。

    2.6阳性克隆酶切鉴定随机挑取6个单克隆质粒以Sfi I和Not I双酶切，均有目的片段释放，见图4。M:100bp marker;

    1:VL基因;2：VH基因

    图1VH和VL基因扩增

    产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定 M:100 bp marker;

    1:scFv基因

    图2scFv基因的琼脂

    糖凝胶电泳鉴定1：DNA Marker；2?7: PCR反应阳性；8：PCR反应阴性

    图3随机挑取克隆抽提质粒PCR反应1:DNA Marker, 2?7：均可见scFv的片段(下)和载体(上)

    图4 PCR反应阳性的质粒用Sfi I 和Not I酶切结果 3讨论自从首次报道用小鼠B细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体（mAb）以来约有140种目前进行临床试验，大部分仍是由鼠杂交瘤技术生产。而噬菌体抗体为抗体的片段，分子小、穿透力强、廓清快、异源性低，而且能在原核系统中表达，易于生产。利用抗体库技术可简便地制备出针对不同肿瘤患者多种肿瘤的scFv片段，这些scFv片段与细胞毒素、破坏细胞的酶和细胞因子等连接后，可形成对肿瘤细胞有特异性杀伤作用的复合物，称为免疫毒素或生物导弹。对感染性疾病、器官移植排斥反应的防治及肿瘤的早期诊断、，以及手术及化疗后晚期肿瘤的辅助治疗均具有广阔的应用前景[4,5?7]。噬菌体展示库技术在一定程度上较好地模拟了体内抗体生成亲和力成熟过程，可快速高效地从大量克隆中筛选展示特异性抗体的噬菌体，为制备高亲和性的抗体提供了有力工具，其特点是“它既可识别相应的抗原并与其结合，又能够感染宿主菌进行再扩增”，该技术可绕过免疫制备全人源性抗体，可有效避免鼠源性抗体在人体应用时诱发产生人抗鼠抗体(HAMA)等不良反应。它将表型(与抗原特异结合)与基因型(含V区基因)联系在一起，把识别抗原的能力和进行再扩增的能力结合起来，是一种高效的筛选体系，在人源性特异抗体的筛选和制备上独具优势[8?10]。目前的研究大都是根据Kabat等[11]的免疫球蛋白数据库的信息来设计引物。扩增Ig可变区引物的设计，一般可选：1) 5’端引物选Ig前导肽保守序列，5’端引物也可选Ig分子骨架区(FRl)的保守序列；2) 3’端引物常选J区保守序列，构建Fab抗体库，则在重链铰链区和轻链恒定区设计引物；3) 依据抗体基因家族保守序列设计引物；4) 设计多套引物分别扩增，为保证引物与模板最大匹配，扩增出所有基因，有时尚需采用简并引物。本研究是根据上面第3条设计引物的。PCR引物的设计是影响抗体库有效表位多样性的因素之一。引物设计应尽可能包含绝大部分可变区基因类型[12]。可变区基因家族中以Vγ3型和Vκ3型最多见。因此在引物的简并性问题上，我们选择了以κ轻链为主的核苷酸序列。由于作为模板的B细胞来源于淋巴结，因此在选择重链可变区的简并引物时，我们选择了以IgG型重链为主的核苷酸序列。设计后的引物符合引物的一般原则：各引物间3’端不存在互补性。目前人源抗体库的主要来源是外周血淋巴细胞。构建一定容量的抗体库需要约1×107个B淋巴细胞，这意味着至少需要200  ml外周血。因此临床操作十分不便。本实验以食管癌手术个癌肿周围转移淋巴结标本为来源，构建人源抗体基因文库。以此来源的B细胞数量多，且可能经过食管癌相关抗原刺激，是构建食管癌相关的人源抗体库的最佳来源。构建大容量的人源抗体基因文库是噬菌体抗体库技术的关键步骤。影响抗体库有效表位多样性的因素很多，最主要的是宿主菌的转化效率和PCR引物的设计。一般来说，细菌的转化效率介于107~108 cfu／μg之间。本文用10％超纯甘油制备了高转化效率的TG1感受态菌。用pUC18标准质粒测定转化效率达到108 cfu/μg，PCR连接产物的转化效率也能达到2×107 cfu/μg, scFv的阳性插入率为91.7%，说明此方法制备的大肠杆菌基本达到抗体库构建的要求。常用的单链抗体构建方式有两种：一种是将重链基因和轻链基因通过不同的酶切位点先后克隆入表达载体，载体本身自带连接肽基因序列，这种方法操作步骤较为复杂，抗体库的多样性易于在反复的克隆操作中丢失；另一种是采用SOE?PCR的方法，先将重链和轻链可变区基因拼接起来，再通过罕见的酶切位点克隆入表达载体。本实验成功地从食管癌转移淋巴结中扩增并克隆了抗体可变区基因，构建人源单链抗体基因文库、为进一步建立大容量的噬菌体抗体筛选文库打下基础。

【】
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