肺癌组织细胞FHIT基因启动子甲基化和转录表达

           作者：余宗涛， 袁亚莉， 张吉才， 高琼， 王元元

【摘要】  目的探讨FHIT (fragile histidine triad,脆性组氨酸三联体)基因表达水平及其启动子CpG岛甲基化状态与肺癌发生的关系。方法用实时定量PCR检测FHIT mRNA在肺癌组织、肺癌旁组织与去甲基化剂5?氮杂?2’?脱氧胞苷（5?Aza?2’?deoxycytidine、5?Aza?CdR）处理前后A549细胞株中的表达，用甲基化特异性PCR（MS?PCR）检测FHIT启动子CpG岛甲基化状态。结果FHIT mRNA在肺癌旁组织中全部表达，在肺癌组织中表达缺失率为48.89%（22/45），且表达量低于正常肺组织（t=-15.851，Ｐ<0.001），但在不同年龄和性别、肿瘤大小、恶性程度、肿瘤分类的差异无显著性；FHIT基因启动子在肺癌组织中发生甲基化的频率为40%(18/45)、在癌旁组织中频率8.7%(2/23)（χ2 =7.184, Ｐ<0.01），18份启动子区甲基化的肺癌标本中，10份同时伴有mRNA表达缺失。结论在肺癌组织中，FHIT基因启动子甲基化频率明显升高，其表达缺失或下调，提示FHIT启动子甲基化可在肺癌发生和发展中起一定作用。

【关键词】  肺癌；CpG岛甲基化；MS?PCR；FHIT基因

    1资料与方法

    1.1资料

    1.1.1标本来源收集湖北省十堰市太和2005 年3月～2006 年2月手术切除肺癌新鲜标本45例，男28例、女17例。小细胞肺癌（SCLC）8例、非小细胞肺癌（NSCLC）37例。全部标本均经病理证实。连同23例距离肿瘤边缘2cm外正常对照组织。-80℃冰箱保存备用。

    1.1.2A549细胞株培养及药物处理将对数生长期A549细胞制成5×104/ml细胞悬液，5%  CO2条件下培养24h后，分别用5×10-6mol/L和5×10-5mol/L浓度5?Aza?CdR处理，24h后弃去药液并重新更换含新鲜培养液的药液，浓度同前，连续作用3d后弃去药液，用完全培养液继续培养4d后进行实验，用同体积PBS处理的细胞作为对照组。

    1.1.3主要试剂及及仪器Wizard DNA clean up、Reverse Transcription System A3500、Trizol Reagent(美国Promega公司)； 5?Aza?CdR(美国Sigma公司)；人肺癌细胞株A549购自武汉大学生物保藏中心；PE7000(美国ABI公司)。

    1.1.4引物合成FHIT甲基化引物[4](5’?ＴＴＧＧＧＧＣＧＣＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＣＧＣ?3 ’； 5’?ＣＧＴＡＡＡＣＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＣＣＡＣＴＡ?3’)，扩增片段长度为74bp；FHIT非甲基化引物[4](5’?TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTTTATG?3’；5’?CATAAACAACACCAACCCCACTA?3’)片段长度为74bp； FHIT?mRNA引物[4](5’?GCTCTTGTGAATAGGAAACC?3’； 5’?TCACTGGTTGAAGAATACAGG?3’)片段长度为532bp；GAPDH?mRNA引物[5] （5’?GAAGTTGAAGGTCGGAGTC?3’； 5’?GAAGATGGTGATGGGATTTC?3’）片段长度为226bp（北京赛百盛公司）。

    1.2方法

    1.2.1组织、细胞DNA提取以经典酚?氯仿抽提法提取组织DNA，经紫外260nm定量后于-80℃保存备用。

    1.2.2组织、细胞RNA提取后逆转为cDNA用Trizol操作说明书进行提取组织及细胞RNA，提取后溶于无RNA酶的双蒸水中，立即用试剂盒A3500逆转为cDNA备用。

    1.2.3基因组DNA的磺化修饰参照[6]，取4μg（总体积为50μl）基因组DNA，经变性、碱基修饰、脱盐后回收再脱去磺化基团，用预冷酒精沉淀回收。离心干燥后重新溶于50μl 去离子水中，置-40℃备用。

    1.2.4MS?PCR磺化修饰后的基因组DNA 50～100ng (3μl)，10×buffer  3μl，2mmol/L dNTP 3μl，25mmol/L氯化镁3μl，Taq 酶2U(1μl)，上下游引物各2μl (12pmol)，20×SYBR Green Ⅰ 0.75μl，去离子水补齐至30μl。置PE7000仪进行扩增：95℃变性3min，(95℃×60s, 58℃×30s, 72℃×60s) ×40，在72℃读取荧光值，最后一个循环72℃延伸5min。

    1.2.5RT?PCR用无RNA酶的双蒸水稀释cDNA至100μl，PCR反应体系及循环参数同MS?PCR。

    1.2.6FHIT?mRNA相对定量方法利用检测得到的Ct值和得到的扩增效率，以GAPDH mRNA的量为参照，计算FHIT mRNA的相对量。FHIT mRNA/GAPDH mRNA用下述公式计算：(1+EGAPDH) Ct (GAPDH)/(1+EFHIT) Ct(FHIT)[7]。

    1.2.7统计学分析用SPSS10.0软件分析，mRNA表达水平定量测定用t检验，启动子甲基化状况用卡方检验。

    2结果

    2.1MS?PCR检测结果肺癌基因组DNA标本中，有10例（其中SCLC  3例）只存在甲基化PCR产物，另外35例标本中都存在非甲基化PCR 产物，其中既有甲基化又有非甲基化产物的8例（其中SCLC 1例）；而在23例正常对照组织中，存在甲基化2例，且均可检测出非甲基化产物的存在，两者之间差异有统计学意义，见表1；在年龄、性别、分化程度、肿瘤的病理类型、肿瘤大小差异无统计学意义（P>0.05）。表１FHIT甲基化化状况及mRNA相对定量 组织病例注：  ①   χ检验：χ2 =7.184、 P<0.01；②     两独立样本t检验：t=-15.851、 P<0.0012.2靶基因FHIT mRNA的相对定量癌旁组织中，FHIT mRNA相对定量在0.85±0.11，而在检出甲基化的18例肺癌组织中，10例FHIT mRNA低于检测下限；在肺癌标本中 FHIT  mRNA的相对定量在0.24±0.20，差异显著；在A549细胞株中，FHIT mRNA测定比值为0.56，但用5?Aza?CdR处理后，其FHIT mRNA测定比值为0.97。

    2.3PCR产物分析经2%琼脂糖凝胶电泳证实了是一条特异的目的带, 见图1~3。图1 MS?PCR 检测肺癌中FHIT 基因

    甲基化状态电泳图M=74bp，  U=74bp图2管家基因GAPDH(226bp)内对照电泳图M：甲基化； U：未甲基化； DW：蒸馏水；

    Blank：空白对照； Marker：分子量标准

    图3FHIT mRNA(532bp) RT?PCR电泳图3讨论我们实验组用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR测定FHIT?mRNA在45例肺癌组织中的相对定量，其表达缺失率高达48.89%(22/45)，且即使表达其表达量也显著降低，而在相对应的23例癌旁正常组织中几乎全部正常表达，两者的表达差异显著但与病人的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤的病理类型等病理因素不相关。表明FHIT的表达缺失与肺癌的发生有一定的相关性，提示FHIT可能为肺癌的候选抑癌基因。用MS?PCR检测肺癌组织FHIT启动子甲基化率，40.00%的病例标本存在FHIT基因启动子区域CpG位点甲基化。而正常对照组织中，存在甲基化的仅有8.70%，两者差异显著。表明在肺癌组织中，FHIT基因启动子区域确实存在CpG位点被甲基化的现象。在18例甲基化阳性的标本中有10例FHIT表达缺失，A549肺癌细胞株检测甲基化阳性，用5?Aza?CdR处理后FHIT?mRNA相对定量显著增高，这是由于5?Aza?CdR去甲基化，使由于启动子甲基化而沉默的FHIT再次表达，说明基因启动子甲基化可以使基因表达缺失或下调。根据已被广泛证实的启动子区域的DNA甲基化胞嘧啶的密度和基因转录活性的相互关系[8]，基因由于启动子甲基化而失活，不仅抑制基因的表达，还改变蛋白和DNA的相互作用，导致染色质结构的改变，是抑制基因活性的一种重要机制。抑癌基因FHIT由于启动子甲基化而完全或部分失活，失去对细胞异常增殖的抑制调控，促进肺癌的发生。总之，我们通过检测肺癌组织中FHIT基因启动子甲基化及在肺癌细胞株A549上的去甲基化剂5?氮杂?2’?脱氧胞苷处理，比较完整地阐述了FHIT基因启动子甲基化导致FHIT基因表达失活机制以及在肺癌发生过程中所发挥的作用。

【】
  ［1］Barnes LD,Garrison PN,Siprashvili Z,et al.Fhit, a Putative Tumor Suppressor in Humans, Is a Dinucleoside 5',5' ''?P1,P3?Triphosphate Hydrolase[J]. Biochemistry,1996, 35(36)： 11529?11535.

[2]Ji L, Fang B, Yen N, et al. Induction of Apoptosis and Inhibition of Tumorigenicity and Tumor Growth by Adenovirus Vector?mediated Fragile Histidine Triad (FHIT) Gene overexpression[J]. Cancer Res，1999, 59(14):3333?3339.

[3]Bird AP. CpG?rich?island, and the function of DNA methylation[J]. Nature，1986, 321(6067)： 209?213.

[4]Dhillon VS, Shahid M, Husain SA. CpG methylation of the FHIT, FANCF, cyclin?D2, BRCA2 and RUNX3 genes in Granulosa cell tumors (GCTs) of ovarian origin[J]. Mol Cancer， 2004,1（3）:33.

[5]Kanai Y,Ushijima S,Kondo Y,et al.DNA methyltransferase expression and DNA methylation of CPG islands and peri?centromeric satellite regions in human colorectal and stomach cancers[J]. Int J Cancer， 2001, 91(2): 205?212.

[6]Herman JG, Graff JR, Myohanen S, et al. Methylation?specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1996, 93(18):9821?9826.

[7]陈英剑,胡成进,赵苗青.大鼠TGF2β mRNA 表达水平的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT?PCR方法的建立[J]. 实验诊断学，2005，9（2）:279?281.

[8]Costello JF, Fruhwald MC, Smiraglia DJ, et al. Aberrant CpG?island methylation has non?random and tumour?type?specific patterns[J]. Nat Genet， 2000,24(2):132?138