乳腺癌患者外周血表皮生长因子受体mRNA与组织中蛋白表达的相关性及其意义
作者：李锋，翟勇平，尤向辉，任军
【摘要】 目的本研究旨在检测乳腺癌患者外周血EGFR mRNA的表达，评价其作为循环乳腺癌细胞标志的可能性；结合相应肿瘤组织中EGFR蛋白的检测，分析两者的相关性；并结合临床病理资料综合分析，探讨其在乳腺癌患者外周血中表达的意义。方法以RT?PCR法,分别对40例乳腺癌患者、25例良性乳腺病患者和30例健康人外周静脉血进行EGFR mRNA检测。免疫组化法检测相应肿瘤组织中EGFR蛋白的表达情况。结果乳腺癌组外周静脉血中EGFR mRNA检出率(32.5%)与健康人组（0）和良性乳腺病患者组（0）间差异均存在统计学意义（P<0.01）。免疫组化法检测到乳腺癌患者相应肿瘤组织中有25例（62.5%）EGFR蛋白阳性，组织中EGFR蛋白表达级别高的患者其相应外周血EGFR mRNA的检出率也高。EGFR mRNA阳性表达与临床分期、组织学分级及ER间存在明显的相关性，而与病理类型、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、PR和HER?2间无明显相关性。结论RT? PCR法检测乳腺癌患者外周血EGFR mRNA有望成为检测循环乳腺癌细胞的有效方法。结合临床病理资料分析，RT?PCR法检测外周血EGFR mRNA有助于判断乳腺癌的预后，有益于乳腺癌微转移的早期诊断、方案的选择及治疗疗效的监测。
【关键词】 Breast cancer
1资料与方法
1.1资料
1.1.1病例选择选择2004年9月~12月在西京肿瘤科、普外科住院未经任何治疗的乳腺癌患者（术后病理证实）和此期间在西京医院肿瘤科和放疗科住院的复发或转移并且4周之内未做过抗肿瘤治疗的乳腺癌患者，共40例。其中未曾治疗的患者26例、Ⅰ期2例、Ⅱ期18例、Ⅲ期5例、Ⅳ期1例(参照TNM国际分期标准)；治疗后复发或转移的患者14例，全部为Ⅳ期。乳腺良性疾病组共25例，来源于此期间西京医院普外科住院病人，包括乳腺纤维瘤患者12例、乳腺增生患者10例、乳腺炎患者2例和巨乳症患者1例。另取30例健康献血员外周血作为正常对照。乳腺癌患者同时采集其临床病理资料并且收集手术后石蜡标本作EGFR蛋白免疫组化染色。
1.1.2细胞株MCF?7乳腺癌细胞株由第四军医大学生化教研室马龙洋硕士惠赠。
1.1.3主要试剂胎牛血清、DMEM、RNase?free DNase I等购自Gibco/BRL公司。淋巴细胞分离液等购自华美生物公司。TRIzoL Reagent为Invitrogen产品。M?MLV RT、M?MLV 5×Reaction Buffer、Oligo (dT)15 Primer为Promega产品。4×dNTP和100 bp DNA Marker为Takara产品。rTaq DNA聚合酶为TOYOBO产品。小鼠抗人EGFR IgG和SP9000免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术公司。
1.1.4引物EGFR的引物参照[6]设计，上游引物：5' CTTCTTGCAGCGATACAGCTC 3', 下游引物： 5' ATGCTCCAATAAATTCACTGC 3'，扩增片段大小共440bp；管家基因的β?actin cDNA片段作为内参照，上游引物：5' TTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTC 3', 下游引物：5' GTCGGATTGATGAAACCCAGACACA 3'，扩增片段大小共168bp。EGFR的上下游引物均跨越内含子设计，避免了DNA干扰，由上海生物工程技术有限公司合成。
1.2方法
1.2.1细胞培养使用DMEM+10% FBS培养，胰酶消化法传代。
1.2.2血样处理采集患者静脉血5ml置入EDTA管抗凝，每位患者在清晨和下午各采样1次。采样后1~3h内快速处理，Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，加入1ml Trizol Reagent溶解。收集大量样本，3个月内一并提取RNA。
1.2.3总RNA的提取按照Trizol Reagent说明书步骤操作。提取出的RNA 溶于DEPC处理水10~20μl中（视RNA量定），-80℃保存。紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用RNase?free DNase I（Gibco?BRL）去除混杂的DNA。
1.2.4反转录反应取1μg RNA做逆转录，反应体系参见M?MLV RT（Promega）说明书。转录出的cDNA于-20℃保存备用。
1.2.5聚合酶链式反应取反转录产物cDNA 2μl，加rTaq DNA聚合酶0.2μl（1 U）, 10×PCR buffer 2μl, MgCl2 1μl，4×dNTP 2μl，mRNA引物（50pmol/μl）：上下游各0.5μl ,灭菌去离子水11.8μl，反应总体积20μl。循环参数如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。对第一轮PCR结果经电泳紫外光成像肉眼判断为阳性的，均进行双重PCR，扩增目的基因的第二轮PCR，取2μl第一轮PCR产物作模板，反应体系和条件与第一轮PCR相同。不含mRNA的样本作为RT?PCR的阴性对照，MCF?7乳腺癌细胞株提取的RNA作为阳性对照。
1.2.6PCR产物鉴定取PCR反应产物10μl，加2μl 6×loadingbuffer上样于含有1mg/ml溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，80V电泳30～40min，紫外光下自显影，经机扫描成像在相应位置(168bp、440bp)出现肉眼可见条带判为阳性。只要患者两份血样中的一份经处理后出阳性结果，即可判断为阳性。
1.2.7免疫组化参照SP?9000试剂盒说明进行。 参照Shimizu等[7]的评分方法, 依据棕色反应的阳性强度及阳性细胞占癌细胞的比例综合判断结果。
1.3统计分析由SPSS12.0或SAS软件完成，P<0.05可认为具有统计学意义。
2结果
2.1外周血EGFR mRNA的表达所有样本的RNA经1%凝胶电泳可见28S、18S和5S条带，28S/18S为1.5~2.5， RT?PCR可扩增出β?actin片段，证明RNA提取完整，反转录成功。RT?PCR结果示：30例健康人和25例良性乳腺病患者外周静脉血中EGFR mRNA的表达均为阴性，40例乳腺癌患者外周静脉血中检测出13例EGFR mRNA阳性(Ｄ32.5%Ｆ)，见图1，与健康人组和良性乳腺病患者组间差异均存在统计学意义（P<0.01）。
2.2组织中EGFR蛋白免疫组化结果EGFR蛋白在组织中的阳性表达主要在细胞膜和细胞质中，表现为棕黄色颗粒状。40例乳腺癌组织中有25例EGFR蛋白阳性，其中+++的有10例，++的有7例，+的有8例，阴性的有15例，见图2、3。
2.3未曾组和治疗后复发转移组外周血EGFR mRNA表达情况的比较在26例未曾治疗患者中检测出5例EGFR mRNA阳性(占19.2%)，在14例复发转移患者中检测出8例EGFR mRNA阳性(占57.1%)，两组相比P=0.031，差异有统计学意义。
2.4外周血EGFR mRNA检出与相应原发肿瘤病灶中EGFR蛋白表达的关系表1数据显示：EGFR蛋白阴性组、+组、++~+++组3组之间检测到EGFR mRNA的差异有统计学意义（P=0.00002， 双向无序RXC表的Fisher确切概率法，由SAS软件完成）。EGFR蛋表1外周血EGFR mRNA检出与相应的
原发肿瘤病灶中EGFR蛋白表达的关系EGFR proteinEGFR mRNA+-P－015+170.00002++~+++125双向无序RXC表的Fisher确切概率法，由SAS软件完成白阴性组与++～+++组之间检测到EGFR mRNA的差异有统计学意义（Ｐ=0，<0.0125），EGFR蛋白+组与++～+++组之间差异也有统计学意义（Ｐ=0.011，<0.0125），但EGFR蛋白阴性与+组之间差异无统计学意义（Ｐ=0.348，>0.0125）（以上由四格表资料的Fisher确切概率法，SPSS12.0软件完成）。
2.5外周血EGFR mRNA的表达与临床病理参数之间的关系表2和3显示， EGFR mRNA的检出与病理类表2 全部患者外周血EGFR mRNA表达4aa 双向无序RXC表的Fisher确切概率法，由SAS软件实现； b 四格表资料的χ2检验，由SPSS12.0软件实现型之间P=0.5391，与肿瘤大小之间P=1.0000，与腋窝淋巴结转移之间P=0.8261，与PR之间P=0.1450，与HER?2之间P=0.2980，以上P均大于0.05；组织学分级：3组之间差异存在统计学意义（Ｐ=0.0265）；临床分期：Ⅰ、Ⅱ组和Ⅲ、Ⅳ组之间差异存在统计学意义（Ｐ=0.0020）；EGFR mRNA与ER存在明显负相关（Ｐ=0.0180）。
3讨论
由于血浆中富有大量的RNA酶，没有游离的mRNA，因此通过RT?PCR技术检测到的mRNA显然来自外周血中完整的循环细胞，选择恰当的靶mRNA是决定检测结果是否可靠的重要因素[8]。进入血液的癌细胞仍保留自身的特异性标志物,若在血液中检测出此标志物,则判断癌细胞可能已发生了转移。Diel等[9]采用大样本乳腺癌多变量分析结果显示,微转移是一个独立的预后指标,其价值优于肿瘤的分级和分期。本实验利用RT?PCR法探查EGFR mRNA来检测乳腺癌患者循环肿瘤细胞。考虑到肿瘤细胞存在间歇入血的可能性，本实验设同一病例分别于两个不同时间点采血，一份阳性即算阳性，提高了检出率。本实验中40例乳腺癌患者外周血检测出13例EGFR mRNA阳性(32.5%)，而25例良性乳腺病患者和30例健康人无一例检测到阳性，说明EGFR mRNA作为循环乳腺癌细胞的标志具有较高的特异性。这一结果与Gazzaniga等[6]在膀胱癌，Leitzel等[10]在乳腺癌，Mitsuhashi等[5]在宫颈癌中得出的结论一致。EGFR mRNA在正常人外周血单个核细胞中一直没有被检测出，但De Luca等[11]近来在健康人中检测到10.5%的阳性率, 我们认为以上差异可能因单轮和巢式RT?PCR的敏感性不同所致。本实验EGFR mRNA的总检出率为32.5%（13/40），转移性病例（腋窝淋巴结或远处转移）中检出率为40.7%（11/27），低于De Luca等[11]报道的EGFR mRNA在转移性肿瘤中的检出率59%，分析可能因单轮和巢式RT?PCR的敏感性不同，高于Leitzel 等[10]在转移性乳腺癌中的检出率22%，分析可能因本实验于不同时间点采血增加了检出率。这与章希炜等[12]实验结论一致：检测胃癌、大肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达，外周血重复采样阳性率高于单次采样(P<0.05)。本实验初治组与复治组EGFR mRNA的检出率分别为19.2%和57.1%，两者之间差异有统计学意义，分析这与本复治组全部为Ⅳ期远处转移性病例有关，相应的肿瘤组织恶性程度较高、侵袭性强，癌细胞血中播散几率大，因此EGFR mRNA的检出率会高。这与Kim等[13]应用免疫磁珠分选和免疫细胞化学方法研究外周血微转移得出的结论一致：循环肿瘤细胞在早期能手术的乳腺癌患者中少见，但在转移性乳腺癌的患者中多见。本实验40例乳腺癌组织中有25例EGFR蛋白阳性，阳性率62.5%。所有外周血中检测到EGFR mRNA阳性的病例，相应的原发肿瘤病灶中EGFR蛋白均为阳性，血液中EGFR mRNA阳性高度提示肿瘤组织中表达EGFR蛋白。这与Gazzaniga等在膀胱癌中得出的结果一致[6]。因此，检测外周血EGFR mRNA有益于乳腺癌患者的预后评价、辅助治疗的选择（尤其针对EGFR蛋白的单抗）及治疗的监测。EGFR蛋白+组与++～+++组之间检测到EGFR mRNA的差异有统计学意义，说明高表达EGFR的肿瘤组织较低表达的易发生瘤细胞血液播散，间接证实了肿瘤组织中高表达EGFR易发生肿瘤转移的观点[4,14]。本实验首次分析EGFR mRNA在乳腺癌患者血液中的表达情况与临床病理参数之间的关系。研究发现EGFR mRNA阳性率随组织学分级（肿瘤的异型程度）增加及临床分期的进展而增高,显示肿瘤患者外周血EGFR mRNA的表达与肿瘤侵袭、转移间有明显相关性。目前公认雌激素受体（ER）阳性乳腺癌的细胞一般分化好,慢；ER 阴性的乳腺癌则分化差,侵袭性强,恶性程度高。结果显示EGFR mRNA与ER存在明显负相关，进一步证实外周血EGFR mRNA阳性的患者肿瘤恶性程度较高。值得注意的是外周血EGFR mRNA的检出与腋窝淋巴结有无转移无明显相关性，这与乳腺癌转移特点相符,既乳腺癌通过血行转移与通过淋巴道转移属于不同的转移途径。因此对于腋窝淋巴结阴性的病例若外周血EGFR mRNA阳性，必需采取辅助化疗。对于肿瘤组织中EGFR蛋白阳性，血液中EGFR mRNA阴性病例的预后值得进一步随访研究。本实验通过小样本的研究，初步结果提示：（1）RT ? PCR法检测乳腺癌患者外周血EGFR mRNA有望成为检测循环乳腺癌细胞的有效方法；（2）结合临床病理资料综合分析，RT?PCR法检测外周血EGFR mRNA有助于判断乳腺癌的预后，有益于乳腺癌微转移的早期诊断、治疗方案的选择及治疗疗效的监测。虽然微转移能否在宿主组织器官形成转移灶，取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态以及宿主组织器官微环境[15]。但动物实验表明[16]仍有0.01%的循环肿瘤细胞能达到下一器官并发展成显性转移。循环肿瘤细胞的检出对提示肿瘤远处转移的发生或已存在的潜伏病灶，以及判断预后提供了重要依据。因此，EGFR mRNA RT ? PCR检测为临床常规检测乳腺癌微转移，预后评价，监测乳腺癌综合治疗效果，提供了一个可行的办法，值得进一步研究。
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