结直肠癌中survivin、caspase?3、p21WAF1的蛋白表达及其意义
作者：梁素美，文欣轩，方细堂
【摘要】 目的探讨结直肠癌中survivin、caspase?3和p21WAF1的蛋白表达与临床病理参数的联系以及survivin与caspase?3和p21WAF1蛋白表达之间的关系。方法采用免疫组织化学SP方法检测15例正常结直肠粘膜和62例结直肠腺癌标本中survivin、caspase?3和p21WAF1的蛋白表达。结果结直肠腺癌与正常结直肠粘膜比较，survivin、caspase?3和p21WAF1的蛋白表达差异均有显著性(P<0.05)。survivin 和caspase?3的蛋白表达与淋巴结转移无明显相关（P>0.05）；而与分化程度均显著相关(P<0.05)。survivin蛋白与Dukes分期相关(P<0.05)；但caspase?3的蛋白表达与Dukes分期无关（P>0.05）。p21WAF1蛋白表达与分化程度、淋巴结转移和Dukes 分期均显著相关(P<0.05)。survivin蛋白分别与caspase?3、p21WAF1蛋白表达之间均呈显著负相关(P<0.01)。结论survivin、caspase?3和p21WAF1蛋白在结直肠癌的发生和进展中都起着重要的作用。p21WAF1基因与结直肠癌的恶性进展显著相关，此结论鲜见报道。
【关键词】 结直肠癌；survivin；caspase?3；p21WAF1；免疫组织化学
Expression of survivin, caspase?3 and p21WAF1 Proteins in Colorectal Ccarcinoma and Their Clinical Significance
Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of survivin, caspase?3 and p21WAF1 proteins in colorectal carcinoma and their relationship between their expression and clinical pathology parameter, and correlation between expression of survivin protein and caspase?3, p21WAF1 protein expression respectively. MethodsSP immunohistochemical method was used to detect expressions of survivin, caspase?3 and p21WAF1 proteins in 15 normal colorectal mucosa and 62 colorectal carcinoma. ResultsColorectal carcinoma compared with normal colorectal mucosa, there was significant differences of survivin, caspase?3 and p21WAF1 protein expression (P<0.05).No correlation was observed between survivin, caspase?3 protein expression and lymph node metastasis (P>0.05), but survivin, caspase?3 protein expression were both correlated with cell differentiation degree (P<0.05). Positive rates of survivin protein was 44.44%(16/36) in A and B of Dukes phase, which lower than positive rates (73.08%) of survivin protein in C and D of Dukes phase(P<0.05). No correlation was observed between caspase?3 protein expression and Dukes phase (P>0.05). There was significant differences between p21WAF1 protein expression and cell differentiation degree, lymph node metastasis, Dukes phase (P<0.05).A highly negative correlation was present between survivin and caspase?3, p21WAF1 protein expression respectively(P<0.01). Conclusionsurvivin, caspase?3 and p21WAF1 genes may be an important role to formation and progression of colorectal carcinoma. It is rarely reported on relationship between p21WAF1 gene and the malignant progression of colorectal carcinoma.
Key words：Colorectal carcinoma; survivin; caspase?3; p21WAF1; Immunohistochemistry
0引言
结直肠癌的发生机制已证实有多个肿瘤抑制基因和原癌基因的改变，如APC、ras、p53、p16等。多个基因改变的相互作用累加起来，逐渐使得正常结肠上皮通过腺瘤转变为腺癌。近年来，对凋亡调节基因的研究已成为分子肿瘤学的一个热点，如凋亡抑制基因IAP家族中的survivin基因、凋亡促进基因caspase家族的成员等。本研究应用免疫组化技术检测结直肠癌中survivin、caspase?3和p21WAF1的表达情况及其与临床病理参数的关系。
1材料与方法
1.1材料 62例标本均采用我院1999～2002年收治的结直肠癌患者，其中男性38例，女性24例，年龄39~78岁，中位年龄52岁。腺癌的分化程度：高分化9例，中分化40例，低分化10例，粘液腺癌3例，将粘液腺癌归入低分化组一并统计。按Dukes分期标准进行病理分期，DukesA、B、C和D期分别为17、19、17和9例。15例正常结直肠粘膜取自结直肠癌根治标本距肿块切缘5cm以上粘膜。所有病例术前均未经放疗、化疗及免疫。所有标本均经HE染色确诊。
1.2试剂caspase?3为兔抗人多克隆抗体,稀释度为1∶200，survivin为鼠抗人多克隆抗体即用型，p21WAF1为鼠抗人单克隆抗体即用型，以及SP 免疫组化试剂盒均为NeoMarkers公司产品(购自福州迈新生物技术公司)。
1.3检测方法采用免疫组织化学SP法，操作步骤严格按照说明书进行。DAB显色，苏木素复染。用已知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。
1.4结果判断survivin、caspase?3蛋白均为胞质着色，而p21WAF1蛋白则为胞核着色。参照[1]方法先按染色强度打分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色，染色强度需与背景着色相对比；再按阳性细胞所占百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%，染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2分为免疫反应阳性(+)。
1.5统计方法采用χ2检验和四格表的精确概率法判断survivin、caspase?3和p21WAF1蛋白表达与各病理指标的相互关系，运用pearson列联系数来判断survivin分别与caspase?3和p21WAF1蛋白表达之间的关系。所有数据均在SPSS10.0软件上进行统计。
2结果
2.1Survivin、caspase?3的蛋白表达survivin、caspase?3蛋白表达主要定位于胞质（图1~4）。在正常结直肠粘膜和腺癌中，survivin、caspase?3蛋白的阳性表达差异均有显著性(P1=0.001；P2=0.004)。survivin 和caspase?3的蛋白表达与淋巴结转移无明显相关；而与分化程度均显著相关(P1=0.009，P2=0.014)。survivin蛋白表达在Dukes A+B期的阳性率为44.44%（16/36），低于C+D期的阳性率73.08%（19/26），两者相比差异有显著性(P=0.025)；但caspase?3的蛋白表达与Dukes分期无关（P=0.103），见表1。
表1survivin、caspase?3和p21WAF1的表达与结直肠癌临床病理因素的关系（略）
2.2p21WAF1的蛋白表达见表1，p21WAF1的蛋白表达主要定位在胞核，正常的结直肠粘膜也有阳性表达（图5、6）。在正常结直肠粘膜和腺癌中p21WAF1阳性表达率分别为100.0%(15/15)、38.71%(24/62)，两者之间差异有显著性(P=0.001)。p21WAF1蛋白表达与分化程度 (P=0.014)、淋巴结转移 (P=0.003)和Dukes 分期均显著相关(P=0.042)。
2.3Survivin的蛋白表达与caspase?3、p21WAF1的关系caspase?3蛋白表达阴性的34例结直肠癌中survivin蛋白有30例却呈阳性表达，caspase?3蛋白表达阳性的28例结直肠癌中，survivin蛋白有23例却呈阴性表达，二者呈显著负相关(P=0.001)，pearson列联系数为-0.5769。p21WAF1蛋白表达阴性的38例结直肠癌中，survivin蛋白有34例却呈阳性表达，p21WAF1蛋白表达阳性的24例结直肠癌中，survivin蛋白有23例却呈阴性表达，二者呈显著负相关(P=0.001)，pearson列联系数为-0.6423，见表2。
表2Survivin的蛋白表达与caspase?3、p21WAF1的关系（略）
3讨论
近几年来，对survivin的研究已取得一定进展。该基因在发育成熟的正常成人组织中基本不表达，而在癌组织中特异性高表达如胃癌（30.0%）、乳腺癌（70.7%）、结直肠癌（63.5%）[2]、肝癌（70.0%）、胰腺导管腺癌（76.9%）等，提示其在肿瘤细胞发生、过程中扮演了一个重要角色，为此人们对survivin的研究给予了极大的关注。本实验结果显示在结直肠腺癌中survivin蛋白表达的阳性率高达56.45%(35/62)，与正常肠粘膜相比，差异有显著性（P=0.001）。因此可以推测肿瘤正是通过对survivin的过量表达，上调它们在有丝分裂中的抗凋亡作用，从而促进肿瘤细胞的增殖和生长，故survivin与结直肠癌的发生发展有关。本研究还发现survivin蛋白表达与结直肠癌淋巴结转移无关，而与结直肠癌的分化程度显著相关（P=0.009），几乎所有的低分化癌均可检测到survivin的过表达，并且survivin蛋白表达在Dukes A+B期的阳性率为44.44%（16/36）低于C+D期的阳性率73.08%（19/26），两者相比差异有显著性(P=0.025)，以上表明survivin蛋白的过表达与结直肠癌的恶性演进有关。Kawasaki等[3]研究得出survivin基因直接通过抑制caspase的活性而抑制凋亡，并且与结肠癌患者的不良预后相关。以上表明survivin是一个预示结肠癌不良结局的重要参数，证实survivin可作为一个诊断或癌症的新靶点。在本文研究中caspase?3蛋白表达阴性的34例结直肠癌中survivin蛋白有30例却呈阳性表达，caspase?3蛋白表达阳性的28例结直肠癌中survivin蛋白有23例却呈阴性表达，二者呈显著负相关(P=0.001)，pearson列联系数为－0.5769。进一步证实survivin基因的抗凋亡作用的机制是通过caspase 途径实现的。但另发现survivin和caspase?3共同阴性表达4例，共同阳性表达有5例，可能也暗示了survivin基因的抗凋亡作用的机制有的是通过非caspase 途径实现的[4]。目前国内外关于caspase?3基因与人结直肠癌组织的临床病理参数关系的研究报道甚少，大多仅限于结直肠癌细胞系的研究，如Larmonier等[5]研究得出大鼠的结直肠癌组织在脂质A的诱导下激活caspase?3基因，促进了肿瘤细胞的凋亡，而引起肿瘤的退化。本研究中caspase?3蛋白的阳性表达率在结直肠正常粘膜和腺癌中差异有显著性（P＝0.004），提示caspase?3表达降低与结直肠癌的形成有关。caspase?3蛋白表达率与结直肠癌分化程度显著相关（P＝0.014），结直肠癌caspase?3表达阳性，可能提示癌细胞分化程度高，细胞凋亡调控机制障碍程度轻，癌细胞增殖比较弱，其可能机制是caspase?3通过降解其酶底物如多聚ADP?核糖聚合酶（poly ADP?ribose polymerase，PARP）、DNA裂解因子（DNA fragmentation factor，DFF45）和Lamin B等而促进细胞凋亡 [6]。本研究还发现caspase?3蛋白在有淋巴结转移的结直肠癌的阳性率为32.00%（8/25）低于无淋巴结转移的结直肠癌的阳性率为54.05%（20/37），差异无显著性(P=0.087)；caspase?3蛋白表达在Dukes A+B期的阳性率为55.56%（20/36）高于C+D期的阳性率30.77%（8/26），两者相比差异无显著性(P=0.103)；这些相同结论的报道鲜见，值得进一步扩大研究范围深入研究。本研究结果显示在正常结直肠粘膜和腺癌中p21WAF1阳性表达率分别为100.0%(15/15)、38.71%(24/62)，腺癌与正常结直肠粘膜比较差异有显著性(P=0.001)，表明p21WAF1在腺癌中低表达，促进了肿瘤细胞的增殖，与肿瘤的形成有关，可能与p21WAF1低表达不能充分与CDK或cyclin?CDK复合物结合，抑制CDK的活性，阻止细胞增殖、分化有关。目前国内外关于p21WAF1基因与人结直肠癌体内的研究报道甚少，大多仅限于结直肠癌体外的研究，如Han等[7]研究认为在以低浓度的喜树碱处理后的HCT116结肠癌细胞系的衰老发展过程中p21WAF1基因是必须的。本文研究中，p21WAF1蛋白与分化程度相关(P=0.014)，且在有淋巴结转移的结直肠癌的阳性率为16.00%（4/25），显著低于无淋巴结转移的结直肠癌的阳性率54.05%（20/37）（P=0.003）。p21WAF1蛋白表达在Dukes A+B期的阳性率为47.22%（17/36），高于C+D期的阳性率26.92%（7/26），两者相比差异有显著性(P=0.042)。以上表明，p21WAF1蛋白与结直肠癌的恶性进展显著相关，此结论鲜见报道。本研究中还发现，p21WAF1蛋白表达阴性的38例结直肠癌中，survivin蛋白有34例却呈阳性表达，二者呈显著负相关(P=0.001)，pearson列联系数为-0.6423。提示survivin基因的过度表达，抑制了p21WAF1基因的表达，细胞失去了正常增殖周期中凋亡“开关”（check point） 的限制，造成细胞增殖增加，凋亡减少，细胞增殖与凋亡平衡打破，最后导致癌症的发生。Ito[8] 等应用肝癌细胞株体外研究发现，survivin可以与周期素依赖蛋白激酶cdk4 结合，导致p21WAF1蛋白自cdk4 的解离。p21WAF1通过紧密结合于G1期和S期的蛋白激酶（cyclineD1?cdk4 和cyclineE?cdk2），抑制其活性，对细胞增殖停留在G1 期具有重要的作用， p21WAF1 的解离使cdk4 活化，细胞进入增殖周期，最终导致大量细胞无限制增殖。
【】
［1］Iseki K, Tatsuata M, Uehara H, et al. Inhibition of angiogenesis as a mechanism for inhibition by 1α?hydroxyvitamin D3 and 1,25?dihydroxyvitamin D3 of colon carcinogenesis induced by azoxymethane in Wistar rat[J]. Int J Cancer, 1999, 81:730?733.
[2]Sarela AI, Macadam RC, Farmery SM , et al . Expression of the anti?apoptosis gene , survivin , predicts death from recurrent colorectal carcinoma[J]. Gut, 2000, 46(5):645?650.
[3]Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD, et al. Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer[J]. Cancer research, 1998, 58(22):5071?5074.
[4]Shankar SL, Mani S, O′Guin KN, et al. Survivin inhibition induces human neural tumor cell death through caspase－independent and dependent pathways[J]. J Neurochem, 2001,79:426?436.
[5]Larmonier CB, Arnould L, Larmonier N, et al. Kinetics of tumor cell apoptosis and immune cell activation during the regression of tumors induced by lipid A in a rat model of colon cancer[J]. Int J Mol med, 2004, 13(3):355?361.
[6]Boulares AH, Zoltoski AJ, Yakovlev A, et al. Roles of DNA fragmentation factor and poly（ADP?ribose） polymerase in an amplification phase of tumor necrosis factor?induced apoptosis[J]. J Biol Chem, 2001, 276(41):38185?38192.
[7]Han ZY, Wei WY, Dunaway S, et al. Role of p21 in apoptosis and senescence of human colon cancer cells treated with camptothecin[J]. J Bio Chem, 2002, 277(19): 17154?17160.
[8]Ito T , Shirak K, Sugimoto K, et al . Survivin promotes cell proliferation in human hepatocelluar carcinoma[J]. Hepatology, 2000 ,31(5) :1080?1085.
