针刺对脑缺血再灌注模型大鼠海马 caspase?3 mRNA 表达的影响

            作者：冉群芳，倪光夏，项晓人

【摘要】  目的：探讨针刺对脑缺血再灌注大鼠脑组织保护作用的机制。方法：Bederson6级5分法进行神经功能评分和用原位杂交技术检测脑缺血再灌注24h后大鼠海马caspase?3 mRNA的表达。结果：穴位针刺组较非穴位针刺组和模型组更显著的改善大鼠缺损的神经功能(P＜0.05)。穴位针刺可以下调脑缺血再灌注大鼠海马caspase?3 mRNA的表达，与模型组、非穴组相比，差异有显著性(P＜0.01)。结论：针刺能够改善脑缺血再灌注后大鼠的神经功能损伤，其作用机制可能是通过下调caspase?3的表达，抑制凋亡实现的。

【关键词】  针刺;脑缺血;模型，动物;caspase?3 mRNA；原位杂交技术；大鼠；半胱氨酸蛋白酶类

    1  材料和方法

    1.1  实验动物选择及分组  选用院上海斯莱克实验动物有限公司提供的健康雄性成年SD大鼠50只，体重250±30 g，随机分为正常组、假手术组、模型组、穴位针刺组、非穴位针刺组。

    1.2  主要试剂及器械  caspase?3原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，多聚赖氨酸和DAB显色试剂盒购自福建迈新公司，LeicaTP1020全自动组织处理仪，南京小松医疗仪器研究所生产的XS?998B光电仪，北航图像分析系统，华佗牌不锈钢毫针。

    1.3  模型制备  参照Longa(1989年)线栓法并加以改进：SD大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g体重皮内注射)麻醉，仰卧固定。颈部正中切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，仔细分离避免损伤迷走神经。由颈外动脉远心端结扎颈外动脉，用微型动脉夹夹住颈总动脉近心端及颈内动脉，在靠近颈总动脉分叉处用眼科剪在颈外动脉上剪一小口，将直径0.26 mm的尼龙钓丝涂有石蜡的一端沿小口插入颈总动脉，剪断颈外动脉远心端，使颈外动脉和颈内动脉处于同一直线上，移去颈内动脉的动脉夹，经颈总动脉分叉处将鱼线缓慢向颈内动脉入颅脑内的方向推进约17-18 mm，微遇阻力时停止，使鱼线头端到达较细的大脑中动脉起始处。缚紧预先放置于穿刺小口处的丝线，缝合，消毒，于缺血2 h后拔出栓线，建立缺血再灌注模型。假手术组大鼠只分离暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉。正常组不进行手术处理。再灌注2 h后进行神经行为学评分，同时电针治疗。评分标准参考Bederson6级5分法：正常为5级(0分)；对侧上肢不能完全伸展为4级(1分)；向对侧推时抵抗力下降为3级(2分)；提尾时向对侧转圈为2级(3分)；自动转圈为1级(4分)；无自发性活动、意识障碍为0级(5分)。神经行为学评分达到1-4分视为造模成功。

    1.4  干预方法  　　穴位针刺组取穴：根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”，取内关(双侧)、人中、百会、风府。

    　　非穴位针刺组取穴：上述各穴向左侧平移0.5 cm处，共5个点。

    　　针刺方法：在模型成功造成缺血再灌注后2 h针刺1次。两组均留针20 min，并通电针仪刺激，选用XS?998B光电治疗仪，频率f2，刺激强度以保持针刺局部轻微抖动为度。针具为“华佗牌”不锈钢针，0.35×25毫针。百会平刺，内关、风府直刺，深度均为0.5寸，人中直刺0.2寸。非穴位针刺组中百会左侧0.5 cm处刺法同百会，内关、风府左侧0.5 cm处刺法同内关、风府。人中左侧0.5 cm处刺法同人中。

    1.5  标本处理  大鼠经再灌注24 h后，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g体重皮内注射)腹腔注射麻醉大鼠，确定麻醉后大鼠仰卧位固定，用剪刀沿胸骨切一纵行切口，充分暴露心脏，于左心尖处剪一小口，用一支12号灌胃针从小口插入左心室到达主动脉处，并固定；将灌胃针和输液瓶接通，剪开右心耳，滴注37℃温浴的生理盐水150 mL，直至右心耳流出液变成清亮，再滴注4%多聚甲醛磷酸缓冲液(含1‰DEPC)大约200 mL固定。断头取脑，从嘴侧到尾侧冠状切片，切成5等份厚度的脑片，取尾侧的第2片放入4%多聚甲醛(含1‰DEPC)中继续固定1 h后，移入75%酒精脱水中止固定。标本入LeicaTP1020全自动组织处理仪进行脱水、透明、浸蜡12 h左右，然后石蜡包埋；镜下定位，确定海马部位后切片，片厚5 μm。

    1.6  原位杂交检测  按照操作说明书操作：切片脱蜡至水后入3%的过氧化氢溶液中孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水洗3次后胃蛋白酶消化10 min。然后PBS洗3次蒸馏水洗1次，1%甲醛磷酸缓冲液固定10 min。再蒸馏水洗3次后40℃恒温箱中预杂交3 h，加杂交液，40℃恒温箱中过夜。用37℃SSC溶液杂交后洗涤，加封闭液37℃ 30 min，生物素化鼠抗地高辛37℃ 60 min，PBS洗涤4次，加SABC37℃ 20 min，PBS洗涤3次，加生物素化过氧化物酶37℃ 20 min，PBS洗涤4次，滴加新鲜配置的DAB溶液进行显色，以蒸馏水冲洗终止反应，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用北京航天航空大学的图像分析系统进行图像分析。400倍光镜下，均在左侧海马CA1区取3个视野，每个视野随机取10个阳性细胞，各组阳性细胞的平均光密度和平均灰度。图像分析系统提供的平均灰度和平均光密度两个测量指标，反映原位杂交抗原抗体反应后细胞内阳性表达物质的含量变化。阳性表达物质越多棕色沉淀颜色越深，平均灰度数值越小；而平均光密度是表征光的透过情况的，阳性表达物质越多光的透过就越少，其数值越大。

    1.7  统计分析：使用SPSS11.5版统计学软件处理，检测结果以均数±标准差(±s)表示，多组间差异的显著性采用单因素方差分析(F检验)，用Dunnett T3法进行组间的两两比较。

    2  结果

    2.1  各组大鼠神经行为学评分  见表1。

    表1  大鼠神经功能评分(±s)组    别再灌后2 h再灌后24 h正常组    0      0假手术组    0      0模型组2.45±0.69#2.15±0.74##△穴位针刺组2.46±0.65#1.46±1.03##●△非穴位针刺组2.30±1.14#1.56±0.95##●◆△    注：#与正常组、假手术组比较P＜0.05；●与模型组比较P＜0.05；◆与穴位针刺组比较P＜0.05；△组内再灌后2h与再灌后24h比较P＜0.05。

    2.2  各组大鼠脑组织左侧海马CA1区caspase?3 mRNA表达比较  见表2和图1-5。结果显示，正常组平均光密度最低，平均灰度最高，说明正常大鼠脑组织caspase?3表达少。由于假手术组并没有造成脑组织的真正缺血，故表达也较少，与正常组之间无差异。缺血再灌注可诱导caspase?3大量表达，故见模型组平均光密度最高，平均灰度最低。经针刺可以显著降低大鼠脑组织海马caspase?3的含量，且穴位针刺组和非穴位针刺组之间有显著差异(P＜0.01)，说明穴位作用具有特异性。

    表2  大鼠海马CA1caspase?3 mRNA表达(±s)

    组    别平均光密度平均灰度正常组0.27±0.02138.99±6.85假手术组0.28±0.03#137.88±9.60#模型组0.37±0.06##112.79±15.32##穴位针刺组0.31±0.09##△△131.51±20.64##△△非穴位针刺组0.35±0.06##△△□□117.84±17.49##△△□□    注：##与正常组、假手术组比较P＜0.01;△△与模型组比较P＜0.01；□□与穴位针刺组比较P＜0.01。

    3  讨论

    　　研究显示，脑缺血／再灌注时，caspase家族是介导细胞凋亡的一大类调节基因，是细胞凋亡的启动和执行者，其中caspase?3是caspase家族级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用［1］。正常情况下，caspase?3以酶原的形式存在，在缺血/再灌注时其通过细胞表面死亡受体途径和线粒体激活途径激活。激活的caspase?3一方面通过水解特异性细胞蛋白直接导致凋亡，另一方面通过破坏DNA修复蛋白，如多聚ADP?核糖聚合酶(PARP)，抑制DNA 修复，协助凋亡的完成［2?3］。Caspase?3的大量激活直接导致了脑缺血/再灌注时神经元细胞朝不可逆的死亡方向。此外大量研究表明，大脑皮质、海马、齿状回等缺血易损区在脑缺血后caspase?3表达增加，其中海马以CA1区最为敏感［4?5］。

    　　本实验结果显示,MCAO模型大鼠脑组织海马中caspase?3 mRNA含量升高，针刺可以降低caspase?3表达，从而抑制神经元凋亡，促进急性期神经功能的恢复。且穴位针刺组caspase?3  mRNA表达显著低于非穴位针刺组(P＜0.01)，提示穴位作用具有特异性，效果优于非穴位。模型组在再灌注24h后也可以改善大鼠的神经功能，可能是由于再灌注血管再通挽救了部分缺血脑组织的功能，但这种改善作用没有针刺的改善作用强(P＜0.05)。针刺改善MCAO模型大鼠的神经缺损体征，可能是通过下调caspase?3的表达，阻止caspase?3的活化，达到对抗脑缺血后细胞凋亡的目的，对缺血后脑组织具有保护作用。

【】
  ［1］Yamamoto T,Nishioka K.Possible role of apoptosis in the pathogenesis of blcom yeiniinduced seleroderma［J］.J Invest Dermatol，2004,122:44?55.

［2］Neigh GN,Glasper ER, Kofler Julia,et al Cardiac arest with cardiopulmonary resuscitation reduces dendritic spine density in CA1 pyram idal cells and selectively alters acquisition of spatial memory［J］.Eur J Neuroscs,2004,20:1865?1872.

［3］Kitazawa M,Anantharam V,Kanthasamy AG,Didldrin induces apoptosis by promoting caspase?3 dependent proteolytic cleavage of protein kinase cdelta in dopaminergic cells:relevance to oxidative stress and dopaminergic degeneration J［J］.Neuroscience,2003,119:945?964.

［4］尹昌林,熊健琼,文 亮.Caspas?3在缺血再灌注大鼠脑海马神经元凋亡中作用的实验研究［J］.第三军医大学学报,2004,26(14):1245?1247.

［5］刘 雁,高曲文,彭凯润.用定量RT?PCR方法检测脑梗死半影区内凋亡相关基因的表达［J］.老年医学杂志,2006,6(26):790?793.