降钙素基因相关肽在局灶性脑缺血再灌注大鼠脑内的表达
【摘要】 目的：探讨CGRP在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤时表达状况及其在损伤机制中的作用。方法：建立大鼠大脑中动脉缺血2小时再灌注24小时模型，分别采用TTC染色及RT-PCR法观察大鼠脑组织缺血状况及CGRP的表达状况。结果：假手术组大鼠脑组织形态结构正常CGRP呈弱表达；模型组大鼠大脑缺血区组织明显水肿，CGRP表达较假手术组对应区显著升高，P＜0.05。结论：CGRP参与了局灶性脑缺血再灌注损伤，且可能对缺血性脑损害起到一定的保护作用。
【关键词】 局灶性脑缺血再灌注 大脑中动脉闭塞 血红素加氧酶
A study on expression and significance of STAT3 in cerebral tissues of Rat after focal cerebral ischemia and reperfusion
【Abstract】Objective To investigate the effects of the expression of CGRPin cerebral tissues of rat after focal cerebral ischemia and reperfusion.Methods 2 hours right intraluminal middle cerebral artery occlusion with reperfusion was induced in 20 rats,and the specimen of brain were performed at the point after 24 hours reperfusion;expressions of CGRP were detected by RT-PCR method. Results Expressions of CGRP were seen sparsely in the control specimens,and were markly increased afer transient focal cerebal ischemia and reperfusion(p<0.05) Conclusion Expression of CGRP is a significant response to transient focal cerebral ischemia/reperfusion and contributes to the early formasion of vasogenic edema that can be observed all parst of brains.
【Key words】focal cerebral ischemia;reperfusion;heme oxygenase
缺血性脑血管疾病是一种致死致残的常见病、多发病。脑缺血再灌注损伤对脑损害的机制是非常复杂的。机制尚不十分清楚，更缺乏有效的方法。降钙素基因相关肽（CGRP）是由37个氨基酸组成的活性多肽，与降钙素为同种基因产物，是目前已知的体内最强的扩血管物质，广泛分布在脑组织中[1]，在缺氧缺血的脑组织中具有有效的细胞保护作用。鉴于此，本研究旨在建立大鼠大脑中动脉缺血2h再灌注24h模型后，通过RT-PCR法检测大鼠脑组织CGRP mRNA表达的变化，探讨CGRP在脑缺血再灌注损伤机制中的可能作用。
1 实验材料与方法
1.1 动物来源与分组
北京维通利华实验动物技术有限公司提供的SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠20只，体重260～280g。将符合模型成功标准的大鼠随机分为假手术对照组5只；缺血组15只。假手术组按下术模型制备。
1.2 实验方法
1.2.1 脑缺血模型（MCAO）制备
参照Zea-logue等复制局灶性脑缺血模型。将麻醉的大鼠仰卧位固定，颈正中切口，结扎并游离右侧颈总、颈外动脉，在游离段上接近颈内、外动脉分叉处剪开1小口，使4/0号外科尼龙线插入，经过颈总动脉分叉处进入颈内动脉，入颅至大脑中动脉起始处，线插入深度约为（18.5±0.5）mm。手术过程中保持环境在25～30℃，且用棉垫和电烤灯维持大鼠体温于37～37.5℃，并一直保持至动物麻醉苏醒。
造模成功的标准：动物手术后有明显手术侧（即右侧）Horner征（右侧眼睑下垂，眼球凹陷）及对侧偏瘫体症（不能完全伸展左前肢，行走时向左侧倾倒或转圈）[2]。依上述标准将能够存活24h的大鼠选定为最后的实验对象，并进行行为学评分。
1.2.2 取材
再灌24小时后，在大鼠深度麻醉状态下取脑，距大脑前端4mm处及后端3mm处冠状取2mm厚的脑片，再迅速分离左右脑。用消毒好的锡箔纸包好右侧受损脑组织，立即放入液氮中冰冻，然后取出冻存于－70的冰箱中。切下的脑片迅速置于TTC皿中进行染色，来判断脑损伤的程度。
1.2.3 缺血区脑组织STAT3的表达
按Trizol液的说明书提取总RNA。测定其浓度以及260nm和280nm处吸光度比值（A260/280）。引物由大连宝生物工程有限公司合成，引物序列为：上游引物：5’－ATT GAC CTG CCG ATG TCC CCC CGC ACT TTA CAT TCA－3’；下游引物：5’－TCA CAT CGG GGA GGT AGC－3’。总反应体系12μL，30℃反应10min，42℃反应30min，99℃反应5min，5℃反应5min，cDNA产物置于－20℃保存。取5μL逆转录反应液进行PCR扩增，反应条件为94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，扩增28个循环，产物－20℃保存。取PCR产物5μL经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，拍照并用光密度仪扫描分析。通过β-actin光密度值进行标准校正，CGRP mRNA的表达。
2 统计学处理
应用band leader ver.3.0图像分析软件对PCR电泳图像进行分析，把图像信号转化为数字信号，再用SPSS13.0进行统计分析。实验数据采用t检验，P＜0.05，有统计学差异。
3 实验结果
3.1 脑缺血模型判定
造模大鼠苏醒后即呈现脑缺血表现，均出现不同程度Horner综合征，左侧前后肢瘫，以前肢为重。
3.2 RT-PCR结果
RT-PCR结果显示,经琼脂糖凝胶电泳可见CGRP和β-actin分别为387bp和329bp两条带。缺血大鼠脑内CGRPmRNA表达与假手术组有明显差异(P﹤0.05)(图1)。假手术组与缺血24h组CGRPmRNA表达吸光度相对值(CGRP/β-actin)分别为: 0.406、0.441、0.505、0.654、0.748、0.646。如图1。
降钙素基因相关肽是由37个氨基酸组成的活性多肽，具有扩张脑血管[3]、减少脑组织缺血性损伤[4]，对缺氧的神经元有保护和功能恢复等作用[5]。本实验中,首先TT染色结果显示假手术组脑组织结构正常；缺血再灌模型组大鼠缺血区脑组织明显变白,说明造模成功。其次, CGRP在假手术组仅少量表达,而缺血组大鼠脑组织CGRP表达均较假手术组对应区域显著升高。有实验报道CGRP在脑组织中的表达对神经元有一定的的保护作用,但在缺血性脑损害中, CGRP表达与其他应激性蛋白质在缺血性损害和修复过程中的机制及相互关系还不是很清楚，张天林等[7]比较海马缺血及再灌流后现,CGRP含量与CA1、CA2、CA3和CA4区凋亡细胞数呈显著性正相关。认为脑缺血及再灌流后CGRP增加虽有可能增加脑供血,但也可能触发再灌流损伤的发生,而导致神经元凋亡。因此CGRP在脑缺血及再灌流中所起的作用较为复杂，有必要深入研究。
【】
[1] Kress A,Tacobowitz DM,Skofitsch G,Detailed mapping of CGRP Mrna expression in the rat contral nervous system:Comparison with previous immuncyto-chemical findings.Brain Res Bull 1995,36(3):261.
[2] Matsuo Y,Izumiyama M,Onodera H,et al.Effect of a noval thromboxane A2 receptor antagnist,S-1452,on postischemic injury in tats.Strode ,1993,24:2059.
[3] Johnston FG,Bell BA,Robertson IJ,Effect of calcitonin-gine-related peptide on postoperative neurological deficits after subarachnoid haemorrhage[J].Lancet,1990,335:869～872.
[4] Holland JP,Sydserff SGC,Taylor WAS,et al.Calcitonin gene-related peptide reduces brain injury in a rat model of focal cerebral ischemia [J].Strode ,1994,25:2055～2059.
[5]王福庄，丁爱石．海马培养细胞的缺氧损伤及降钙素基因相关肽的保护作用[J]．应用生杂志，1994，10（4）：317～321．
