颈椎后纵韧带胶原、蛋白多糖、钙含量变化的研究
【摘要】 ［目的］通过定量测定颈椎后纵韧带总胶原、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和钙含量改变，探讨颈椎后纵韧带在颈椎病发病机理中的意义。［方法］收集脊髓型颈椎病下位颈椎后纵韧带15例作试验组，同年龄段正常下位颈椎后纵韧带10例作对照，Weossner法测定两组总胶原含量；酶联免疫吸附法测定Ⅰ型、Ⅱ型胶原含量；间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量；甲基百里香酚蓝比色法测定钙含量；进行HE染色和Masson染色，对比观察后纵韧带的显微结构变化特点。［结果］试验组总胶原、Ⅰ型胶原和蛋白多糖含量低于对照组；试验组Ⅱ型胶原含量较对照组高；试验组Ⅰ型/Ⅱ型胶原比值低于对照组；试验组钙含量较对照组高，组间对比均有统计学意义（P＜0.05）；病理结构显示试验组弹力纤维、胶原纤维肿胀，排列紊乱。［结论］颈椎病患者颈椎后纵韧带退变，总胶原、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和钙代谢发生紊乱，颈椎后纵韧带分子水平的生物化学变化与颈椎病发生有密切关系。
【关键词】 颈椎病； 后纵韧带； 胶原； 蛋白多糖； 钙化
颈椎病是以颈椎间盘退变为主要病变基础，导致颈周围肌肉、关节继发性改变和相邻椎体退变增生而直接压迫神经血管所诱发与之相关的临床症状和体征的疾病。后纵韧带退变在颈椎病的发病因素中，占重要地位〔1、2〕。大量的研究表明颈椎后纵韧带退变与基因、环境等多种因素有关。目前国内外对椎间盘及黄韧带的生物化学水平微量变化进行了大量的研究，但对颈椎后纵韧带胶原和蛋白多糖等物质生物化学水平定量变化的相关研究鲜见〔3〕。
本实验通过定量测定实验组和对照组总胶原、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和钙含量变化，同时对比观察两组显微病理变化，为颈椎后纵韧带退变提供分子生物化学量化依据，并探讨颈椎后纵韧带在颈椎病发病机理中的意义。
1 材料和方法
1.1 病例选择 病例组选取本院2005年10月～2006年5月收治病人中的15例脊髓型颈椎病手术患者的C4、5或C5、6节段颈椎后纵韧带，并去除明显骨化块部分，其中男9例，女6例；年龄47岁～63岁，平均年龄54岁，颈椎病均根据临床症状、体征及常规X线、MRI检查明确诊断；对照组由东南大学解剖教研室提供，为同年龄段10例生前无糖尿病史、颈肩痛病史、家族性颈椎病史尸体，C4、5和C5、6颈椎后纵韧带作对照，其中男6例，女4例；年龄45～60岁，平均52岁，在死亡后12 h内取材。标本取得后，用生理盐水冲洗，吸水纸吸干表面的水分，铝锡纸密封放入-80 ℃冰箱储存备用。
1.2 主要试剂和仪器 标准羟脯氨酸（Sigma,USA）；酶标器（Bio Red，USA）；Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶联免疫测定试剂盒（TPI Inc，USA）；甲基百里香酚蓝比色法钙测定试剂盒（南京建成生物技术有限公司，）；Masson三色试剂盒（福建迈新生物技术开发公司，中国）。
1.3 Woessner方法测定羟脯氨酸 标本脱水、脱脂、烘干、称重，加100倍于样本量6 mol/L盐酸在110 ℃分解24 h，旋转蒸发器去除盐酸，双蒸水溶解残留物，加氯胺T溶液室温静置20 min，加过氯酸溶液室温静置5 min，加对苯胺基苯甲醛溶液在60 ℃温箱20 min，取出待冷却，在波长560 nm处测定吸光值。通过羟脯氨酸标准曲线出待测液内的羟脯氨酸浓度，以此推算组织总胶原蛋白含量。
1.4 ELISA测定Ⅱ型胶原的含量 标本称重，脱水脱脂，0.4 mol乙酸浸泡过夜，在冰浴下制备成匀浆，以盐析法提取胶原。酶联免疫吸附法（ELISA）测定Ⅱ型胶原，按试剂盒说明书的步骤进行，在波长450 nm下测定Ⅱ型胶原的浓度，计算含量。
1.5 蛋白多糖含量测定方法 采用间苯三酚分光光度法〔4〕，测定光密度值，转换为量值作蛋白多糖含量的测定。
1.6 钙含量测定 标本烘干称重，研磨成粉末，浓盐酸高温分解，蒸发盐酸，双蒸水溶解残留物，按说明书进行甲基百里香酚蓝比色法测定钙离子含量。
1.7 组织病观察 标本用10％福尔马林浸泡过夜，脱水、透明、浸蜡、切片，Masson染色，光镜观察。
1.8 统计方法 用SPSS 13.0统计软件包对总胶原、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖和钙比值的数据进行分析，结果以x-±s表示，组间差异比较应用两组均数的t检验。P＜0.05表示差异有意义。
2 结果
2.1 标本大体观察 试验组后纵韧带质地变硬，弹性减低，色泽发白，有时可触及质地硬的骨化块。对照组后纵韧带质地柔软，富有弹性，有光泽，湿润。
2.2 Woessner方法测定羟脯氨酸结果（表1）
表1 羟脯氨酸和总胶原含量测定（略）
2.3 ELISA法测定Ⅰ型、Ⅱ型胶原含量及其比值（表2）
表2 Ⅰ型和Ⅱ型胶原含量测定（mg/g）及Ⅰ型/Ⅱ型胶原比值（略）
2.4 间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量和甲基百里香酚蓝比色法测定钙离子含量（表3）
表3 蛋白多糖和钙含量（略）
2.5 组织病理学观察 Masson三色染色胶原纤维呈蓝色，弹性纤维呈红色。实验组镜下出现较多的纤维变性区，弹性纤维减少，甚至呈灶状缺失，胶原纤维增多，纤维肿胀，界限模糊，外形不规则，细胞形态不规则，排列紊乱，细胞数较密（图1、2）。对照组光镜下颈椎后纵韧带主要由胶原纤维和弹力纤维组成，纤维呈波浪状，排列规则，与韧带纵轴一致。纤维间细胞稀疏，主要为纤维细胞，细胞成梭形，长轴与纤维走向平行（图3、4）。
图1实验组HE染色（10×20）（略）
图2实验组Masson三色染色（10×40）（略）
图3对照组HE染色（10×20）（略）
图4对照组Masson三色染色（10×40）（略）
3 讨论
3.1 颈椎后纵韧带的病理变化 后纵韧带以胶原纤维及弹性纤维为主，胶原纤维使韧带组织具有一定的强度和刚度，胶原蛋白含量多少、纤维走行，以及韧带的形状尺寸、截面积，与载荷方向一致的纤维数目多少，纤维宽窄厚薄，决定后纵韧带的强度〔5〕。颈椎后纵韧带承担着颈椎的张力载荷，有防止椎间盘后突出和限制脊柱过度前曲的作用，对颈椎稳定性有重要作用〔6〕。随着年龄增加，椎间盘退变，椎间隙变窄，椎间不稳，椎间异常活动增加，相应节段的后纵韧带受到反复异常刺激。急慢性挫伤时后纵韧带发生出血、炎性水肿等一系列病理变化，造成后纵韧带肿胀肥厚，反复微小出血，血肿机化，甚至发展到软骨化或骨化，并成为压迫脊髓的因素之一。Ono等〔7〕通过病理研究显示颈椎病患者颈椎后纵韧带基质纤维性和非纤维性组织增生。本组实验病理观察显示，与对照组相比较，病例组颈椎后纵韧带明显发生退性变，其纤维之间的紧密联系丧失，纤维排列紊乱，胶原纤维和弹性纤维网断裂，纤维间隙增宽，细胞形态不规则，呈玻璃样变性，进一步证明颈椎病患者的颈椎后纵韧带退变。
3.2 颈椎后纵韧带总胶原变化 羟脯氨酸可作为半定量测定总胶原的指标。和黄韧带、椎间盘等检测结果不同的是〔8〕，本试验测得的结果显示，病例组总胶原较对照组减少。退变的颈椎间盘内处于高压状态〔9〕，椎体不稳，致颈椎后纵韧带长期处于紧张状态，纤维被拉伸，韧带的血管受到挤压，血液供应减少，影响韧带的代谢。缺血缺氧状态，妨碍胶原的合成，妨碍组织的修复。据此，本研究推测椎间盘退变是致颈椎后纵韧带胶原减少的重要原因之一。
胶原纤维减少及其排列紊乱、断裂，使后纵韧带强度和刚度降低。这样反过来改变原有颈椎生物力学的平衡〔6〕，加重颈椎不稳，可见颈椎后纵韧带退变对颈椎病起到恶性循环的作用。
3.3 颈椎后纵韧带Ⅰ、Ⅱ型胶原含量改变及Ⅰ型／Ⅱ型胶原比值意义 Ⅰ型胶原存在于皮肤、韧带、骨等组织中，Ⅱ型胶原蛋白为软骨胶原,Ⅰ型胶原作为韧带的支持物，赋予韧带以张力；Ⅱ型胶原使韧带更能承载抗压应力，二者的比值反应出韧带的抗张力性能及刚度〔8〕。Ⅱ型胶原的分泌与软骨细胞及类软骨细胞相关，Yasui等〔10〕对正常和颈椎病后纵韧带胶原分布进行了检测，发现肥厚颈椎韧带的基质内Ⅱ型胶原增加，Ⅱ型胶原主要包绕类软骨细胞。本试验检测到Ⅰ型胶原减少，Ⅱ型胶原增加，实验组Ⅰ型／Ⅱ型胶原比值明显低于对照组，提示颈椎后纵韧带呈骨化倾向，进一步提示颈椎后纵韧带退变严重程度。
3.4 颈椎后纵韧带蛋白多糖和钙含量变化
蛋白多糖作为韧带一种重要成分，分子中带有大量的负电荷，产生一定的固定电荷密度，对水及阳离子具有较大的亲和力，其体积庞大，可为组织提供良好的水合空间，可维持后纵韧带中的水分。蛋白多糖维持胶原纤维排列有序性，防止胶原纤维的降解。蛋白多糖聚合体还可阻止基质的钙化，使韧带富有弹性。因此，蛋白多糖聚合体在维持后纵韧带的生理功能及防止其退变方面都起到重要的作用〔11〕。
颈椎后纵韧带长期处于高张力状态是致蛋白多糖分解的重要因素之一，蛋白多糖聚合体的分解而引起水分的丢失。早期可以通过自身的修复重新组合成蛋白多糖聚合体；而当组织发生变性时，这种修复过程往往不易进行，最后导致后纵韧带纤维化、骨化，加速后纵韧带的变形、退变，后纵韧带组织的黏弹性及对抗压力减弱。本研究中试验组蛋白多糖较对照组明显减少，为颈椎病患者颈椎后纵韧带的退行性改变提供量化依据。
因退行性改变，蛋白多糖的分解，以及其他多种因素致使颈椎后纵韧带钙过多沉积〔12〕，引起后纵韧带的骨化，试验组的钙含量明显高于对照组，进一步证明了此分子水平的变化。
综上所述，颈椎间盘退变可促进颈椎后纵韧带的退变，退变的颈椎后纵韧带内胶原、蛋白多糖和钙等含量成分的改变，韧带骨化，韧带失去原有的生物学特性，反过来加重了颈椎病。颈椎后纵韧带在颈椎病的过程中起着重要的作用，希望此试验的结果能为以后的临床提供一些思路。
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