脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察

          作者：郭树章　任先军　蒋涛　吴波

【摘要】  　　［目的］采用化学脱细胞方法去除细胞和髓鞘成分制作细胞外基质支架，为桥接脊髓损伤缺损提供理想的天然神经支架。［方法］取SD大鼠胸段脊髓约2 cm，运用冻融+化学萃取（3%脱氧胆酸钠和1 KU/ml DNaseI、RNaseA）的组织工程学方法处理大鼠脊髓组织，并对处理后的脊髓支架分别进行组织学检查，了解脱细胞情况及细胞外基质支架形态。［结果］经过脱细胞处理后，光镜下HE染色脊髓横断面呈网状结构，未见细胞成分存留，纵切面上呈互相交错的管状通路；未见轴突、髓鞘和细胞核。髓鞘染色可见髓鞘脱除彻底，未见髓鞘成分。［结论］本实验采用冻融+化学萃取的组织工程学方法可制备出理想的天然脊髓支架，该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性，有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架,本实验结果显示3%脱氧胆酸钠和1 KU/ml DNaseI、RNaseA进行脱细胞处理两次是较为合适的，能较为彻底去除细胞及髓鞘成分并较为完整地保留细胞外基质的三维结构。

【关键词】  脱细胞脊髓 组织工程支架 大鼠

　　Preparation of acellular scaffold of natural spinal cord and observation of morphology
   
　　Abstract：［Objective］Using a procedure of chemical agent to remove the cells and myethin in spinal cord of rat and to prepare the scaffold of extracellular matrix,so as to obtain an ideal natural spinal cord scaffold to bridge the nerve gap.［Method］Rat spinal cord was cut and treated using the method of freeze thawing and chemical extraction（3%sodiumdeoxycholate and 1KU/ml DNaseI，RNaseA）.Histology was exploited to evaluate the degree of acellular and the structure of the spinal cord scaffold.［Result］In cross section,network of the extracellular matrix was presented in the scaffold.The cells, myethin and axons disappeared after the spinal cord was treated with sodium deoxycholate and DNaseI，RNaseA.Typical network of empty tubes were viewed in longitudinal sections.［Conclusion］An ideal spinal cord scaffold can be produced with the method designed in author?s experiment.This scaffold has similar three dimensional structure with normal spinal cord,which can be used as a graft to bridge the nerve gap directly or as a scaffold to implant the seeding cells in spinal cord tissue engineering.The experiment indicates that cells and myethin can be removed and the three dimensional structure be reserved by chemical extraction with 3% sodium deoxycholate and 1KU/ml DNaseI，RNaseA.Chemical extraction is an ideal method to prepare tissue engineer scaffold of spinal cord.
   
　　Key words：acellular spinal cord；  tissue engineering scaffold；  rat

　　近年来，以组织工程技术修复脊髓损伤是研究的一个新热点。在构建组织工程化脊髓的过程中包括两个最基本的问题，即组织工程支架和种子细胞。其中支架材料及三维结构对效果具有至关重要的作用。目前应用的组织工程支架材料在物理性能、生物性能及其形态结构与正常的在体脊髓相比，都有较大的差距，尚无与脊髓三维结构高度相似且在理化性能也与脊髓相似的支架材料，因此本研究试图探索运用冻融+化学萃取的组织工程学方法制备脱细胞的天然脊髓支架，从而为脊髓损伤修复提供理想的支架材料。
   
　　1  材料与方法
   
　　1.1  材料与仪器
   
　　SD大鼠（第三军医大学大坪实验动物中心），脱氧胆酸钠(北京奥博星公司)，DNase I、RNase A(华美生物工程公司)，恒温回旋振荡器(重庆仪器有限公司)，铁明矾、硼砂及铁氰化钾为新桥医院病理科惠赠。
   
　　1.2  大鼠脱细胞脊髓支架的制备
   
　　以戊巴比妥钠将SD大鼠经腹腔麻醉，背部去毛后消毒，取后正中切口，打开椎板，显露脊髓，取胸段脊髓约2 cm。PBS缓冲液清洗，去除表面血迹，参照Ribatti等〔1〕方法并加以改进：(1)脊髓置于-80 ℃深低温冰箱中冻存1 h，室温下解冻；(2)将脊髓组织置于蒸馏水内，在室温下浸泡6 h，每2 h换液1次；(3)置于3%的脱氧胆酸钠盐蒸馏水溶液（加入适量1 mol/L NaOH至溶液pH值为8～9）连续震荡4 h（恒温回旋振荡器内持续振荡，25 ℃ 100 转/分）；(4)蒸馏水中振荡浸泡3 h，1 h换液1次；(5)置于1 KU/ml DNase和RNase混合液中持续振荡30 min；(6)蒸馏水浸泡3 h，1 h换液1次;(7)重复(3)～(6)再萃取1遍，最后将萃取后的脊髓组织置于冷冻干燥机中冻干，60Co照射消毒，照射剂量2.5 Gy，消毒后-80 ℃冰箱保存。
   
　　1.3  组织学观察
   
　　1.3.1  HE染色
   
　　将化学萃取的脊髓支架和大鼠正常脊髓用10%中性甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋，两种标本均行横切片和纵切片，切片后进行HE染色，光镜观察。

　　1.3.2  髓鞘染色(Weil髓鞘染色法)
   
　　组织切片厚5～8 μm，脱蜡至水，Weil苏木精50 ℃，15 min（10%纯酒精性苏木精5 ml，4%铁明矾50 ml，蒸馏水45 ml），自来水洗15 min，4%铁明矾分化至灰白质分辨明显，必要时用Weigert分化液补充分化（硼砂2 g，铁氰化钾2.5 g，蒸馏水200 ml），自来水洗，脱水，透明，封片，光镜观察。
   
　　2  结果
   
　　2.1  肉眼观察
   
　　在脱细胞、蒸馏水浸泡过程中可见大量白色絮状物自脊髓内析出，脱细胞处理的脊髓支架颜色呈乳白色，半透明状，仍维持圆柱形，粗细为处理前的2/3～4/5，略变短。强度略有下降，韧性与处理前脊髓组织相似，黏性略有增加。

   
　　2.2  HE染色
   
　　正常大鼠脊髓横切面结构，含有大量神经元和胶质细胞，组织结构致密，髓鞘存在。脱细胞处理所获得的脊髓支架横切面上呈大小不等的网眼状结构(图1)，轴突及髓鞘均已消失，未见细胞成分存在。纵切面可见脊髓支架呈交错的纵行管状结构(图2)。
   
　　2.3  髓鞘染色
   
　　正常脊髓切面上可见髓鞘染色呈黑色，无明显破坏，形态规则，厚度正常（图3），脱细胞脊髓未见髓鞘成分或存在极少量髓鞘碎片（图4）。
 
　　图1大鼠脱细胞脊髓横切面，细胞脱除彻底，组织呈网状结构  （HE×200）（略） 

　　图2大鼠脱细胞脊髓纵切面，未见细胞成分，组织结构呈交错纵管状  （HE×200）（略） 

　　图3正常大鼠脊髓Weil染色，髓鞘结构正常，形态规则  （×400）（略） 

　　图4大鼠脱细胞脊髓Weil染色，髓鞘结构消失，无细胞成分存在  （×400）（略）

　　3  讨论
   
　　脊髓损伤后轴突再生和功能恢复一直是骨科及神经外科的难题，虽然近年来脊髓损伤修复取得了一定的进步，但仍未取得突破性进展。组织工程技术通过构建支架并复合合适的种子细胞，为轴突再生提供良好的通路，促进移植细胞存活并提供必需的营养成分，创造适合轴突生长的微环境，因此近年来成为研究的热点，呈现良好的势头。但是目前应用的天然或人工合成材料作为脊髓损伤的支架，其孔隙均通过人工方法制作而成，难以真正模拟正常脊髓传导通路的结构，而且这些支架材料均各有一定的缺点，如：在降解过程中会产生一些降解产物不利于神经元的存活和轴突的再生；与细胞的低黏附性；支架的生物特性、物理特性与正常脊髓相距甚远，不具有仿生性。而且由于制作工艺的限制和脊髓组织结构的复杂性，目前尚不能制作出与脊髓高度相似的三维网状结构。
   
　　同种异体脊髓具有与受体脊髓相同或相似的三维结构，而且胚胎脊髓移植已证实具有促进功能恢复的作用，胚胎脊髓移植涉及伦理问题和来源问题的困扰，而成体异体脊髓则存在强烈的免疫排斥反应。目前已证实排斥反应主要是由细胞成分和髓鞘引起，而细胞外基质成分的免疫原性在同种动物间非常微弱。去除细胞和髓鞘成分后免疫原性将显著降低，这在周围神经支架中已得到了证实〔2～4〕，并且具有良好的功能促进作用〔5、6〕。
   
　　本研究运用冻融结合化学萃取的组织工程学方法来处理大鼠脊髓组织，率先成功制备了天然的脊髓细胞外基质支架，在既往中尚未见有报道。在冻融破坏细胞的基础上，应用脱氧胆酸钠进一步破坏细胞，同时利用脱氧胆酸钠在碱性条件下作用增强的特点，加入适量NaOH从而增强其破坏细胞能力，而且NaOH本身具有细胞破坏作用〔7〕，在此基础上再加入核酸酶彻底破坏细胞及细胞核。在实验过程中作者体会蒸馏水浸泡和冲洗时间一定要充足，才能保证将破坏的细胞成分全部从组织中清除。从组织学检查结果来看，脱细胞处理的神经支架内未见轴突、髓鞘、细胞残留物，表明已较彻底去除了细胞和髓鞘结构，经初步研究具有良好的组织相容性（另文发表）。本实验制作的脊髓支架是一种仿生的天然三维立体管状支架材料，与上述的生物降解材料移植物相比有着根本的不同和先天的优越性。该支架还具有一些其他支架所不具备的优点，如易于获得、不受长度和口径的限制、可进行“等位移植”（如L1脊髓损伤，则制备L1节段脊髓支架进行移植确保结构的相似）和“解剖移植”（即移植物前角与受体脊髓前角相对应进行移植，进一步达到结构相似），对受者不良影响小、易于保存、制作工艺简单等等。在脱细胞的同时该支架保存了细胞外结构。细胞外基质主要成分是层黏连蛋白、纤维黏连蛋白、Ⅳ型胶原等，具有促进引导神经再生的作用。对种子细胞的黏附及其成熟和功能表达又有促进作用。本实验利用组织工程学方法在国内外首次成功地制备仿真脊髓支架，其形态结构是以细胞外基质为主的完整的三维网架，具有良好的仿生性，有可能成为新型理想脊髓组织工程支架。

【文献】
  　　〔1〕 Ribatti D，Conconi MT，Nico B，et al.Angiogenic response induced by acellular brain scaffolds grafted onto the chick embryo chorioallantoic membrane［J］.Brain Res,2003 ,989(1): 9?15.

　　〔2〕 Hudson TW,Zawko S,Deister C, et al.Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration［J］.Tissue Eng,2004 ,10(11～12): 1641?1651.

　　〔3〕 孙明学,唐金树,王鑫,等.去细胞处理对化学去细胞异体神经免疫原性的影响［J］.中华外科杂志,2006,44(4): 275?278.

　　〔4〕 Rovak JM,Bishop DK,Boxer LK, et al.Peripheral nerve transplantation: the role of chemical acellularization in eliminating allograft antigenicity［J］. J Reconstr Microsurg,2005,21(3): 207?213.

　　〔5〕 陈秉耀,侯树勋,衷鸿宾,等.兔化学去细胞神经移植修复大鼠坐骨神经缺损［J］.矫形外科杂志,2003,11(21): 1476?1478.

　　〔6〕 Kim BS,Yoo JJ,Atala A.Peripheral nerve regeneration using acellular nerve grafts［J］.J Biomed Mater Res A,2004，68(2): 201?209.

　　〔7〕 沈楠，金岩，张勇杰，等.去细胞周围神经移植物的制备及生物相容性评测［J］.中国临床康复，2006，10(21)：82?84.