凋亡抑制蛋白Survivin在骨肉瘤中的表达及其与PTEN、cyclinD1蛋白表达的关系
【摘要】 ［目的］探讨Survivin基因的表达在骨肉瘤发生、中的作用及其与PTEN、cyclinD1蛋白表达的相互关系。［方法］应用免疫组化（SP）法检测40例骨肉瘤组织、20例骨软骨瘤组织中Survivin、PTEN、cyclinD1蛋白的表达情况以及Survivin与PTEN、cyclinD1蛋白两者之间的相关性。［结果］Survivin在骨肉瘤中的阳性率为62.5%（25／40），明显高于对照组骨软骨瘤10.0%（2／20）的阳性率（P＜0.01）。PTEN蛋白在骨肉瘤中的阳性表达率为52.5%（21／40），而在骨软骨瘤中为95.0%（19／20），两者相比有显著差异（P＜0.01）。cyclinD1蛋白在骨肉瘤中的阳性率为80.0%（32／40），高于在骨软骨瘤中的45.0%（9／20），有统计学意义（P＜0.05）。Survivin和PTEN两者表达强度之间呈显著负相关（P＜0.01），而Survivin与cyclinD1表达呈正相关（P＜0.01）。［结论］Survivin在骨肉瘤组织中过表达与骨肉瘤的发生有关；PTEN在骨肉瘤组织中失表达，它可能下调Survivin表达，对骨肉瘤起抑制作用：Survivin和cyclinD1在骨肉瘤的发生发展中可能起协同作用。
【关键词】 骨肉瘤 Survivin PTEN cyclinD1 免疫组织化学
Expression of Survivin in Human osteosarcoma and its correlation with PTEN and cyclinD
Abstract：［Objective］To investigate the expression of Survivin and its relationship with expression of PTEN and cyclinD1.［Method］Immonohistochemical method（SP method）was used to detect the expression of Survivin,PTEN and cyclinDl in 40 osteosarcoma tissues and 20 ostanchondroma tissues.［Result］The expression rate of Survivin was significantly higher in osteosarcoma（62.5%）than that in osteochondroma（10.0%）（P＜0.01）.The expression of PTEN wes detected in a grester proportion of osteochondroma（95.0%）than that in osteosarcoma（52.5%）（P＜0.01）.The positive expression rate of cyclinD1 was higher in osteosarcoma（80.0%）than that in osteochondroma（45.0%）.There was a significantly positive correlation between Survivin and cyclinD1,while negative correlation was observed between the Survivin and PTEN expression in osteosarcoma.［Conclusion］Survivin is over expressed in osteosmcoma and PTEN can downregnlate Surviving.Survivin may play an promoting role and PTEN may play an protective role in the development of osteosarcoma.Survivin amd cyclinD1 might play synergetie roles in the process of osteosarcoma.
Key words：osteosarcoma; Survivin; PTEN,cyclinD1; immunohistochemistry
骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤，好发于青少年，对化疗和放疗敏感性较低，预后差，易复发和转移，5年生存率低。目前，在骨肉瘤的诊断和方面尚缺乏有效的指标及方法。
Survivin是近年来发现的一种细胞凋亡抑制蛋白家族成员，除具有较强的抑制细胞凋亡作用外，还有调节细胞周期和肿瘤血管保护等多种生物学特性。它选择性表达于多种常见的恶性肿瘤，而在癌旁正常组织和成人分化组织中不表达。PTEN是人类发现的第1个具有酪氨酸磷酸酶作用的抑癌基因，在调控细胞生长以及凋亡过程中也发挥着重要的作用。本文利用免疫组化技术检测Survivin、PTEN和cyclinD1蛋白在骨肉瘤中的表达，初步探讨Survivin在骨肉瘤发病机理中的作用以及其与PTEN、cyclinD1相互间的关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源
所以病例均为收集青岛大学医学院附属骨科2001年1月～2005年6月手术切除标本。其中骨肉瘤标本40例，术前均未行放疗及化疗。男28例，女12例;平均年龄19.6岁（9～60岁），所有标本均经病理证实。根据Enneking外科分期，Ⅰ级8例，Ⅱ级21例，Ⅲ级11例；组织学分型中骨母细胞型16例，纤维母细胞型13例，软骨母细胞型7例，其他类型（血管扩张型、混合型）4例。每例骨肉瘤病例均经临床、影像学和病理三者结合确诊。选取同期骨软骨瘤标本20例作为对照。所有组织标本均来自本院病理科存档石蜡块，经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片。
1.2 试剂与方法
采用免疫组织化学染色法（SP法）。一抗Survivin兔抗人单克隆抗体、PTEN鼠抗人单克隆抗体及cyclinD1鼠抗人单克隆抗体以及SP试剂盒均为北京中杉金桥生物技术公司产品；一抗工作浓度均为1∶50。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。石蜡切片脱蜡至水，3%过氧化氢室温孵育10 min〔1〕，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，正常羊血清封闭20 min，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明封片，中性树胶封固。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗，作为阴性对照。
1.3 结果判定标准
参照Fromowitz等的方法进行，根据染色强度和阳性细胞数综合评分，分为4级（-，+，++，+++）。
1.4 统计学分析
采用SPSS 10.0软件包中的的x2检验、Spearman等级相关进行统计学分析。
2 结果
2.1 Survivin、PTEN和cyclinD1在骨肉瘤、骨软骨瘤中的表达
Survivin、PTEN和cyclinD1的阳性染色均为棕黄色颗粒，前两者表达部位在细部浆，后者表达于细胞核（图1～3）。三者在骨肉瘤组织中的表达率显著高于其在骨软骨瘤组织中的表达，差异有显著性（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）（表1）。
表1 Survivin、PTEN和cyclinD1在骨肉瘤、骨软骨瘤中的表达（略）
2.2 Survivin、PTEN和cyclinD1在骨肉瘤中的表达与临床病理特征的关系（表2）
从表2中可见Survivin、PTEN和cyclinD1在不同性别、年龄及病理类型的骨肉瘤组织中的表达差异无显著性（P＞0.05）。Survivin在骨肉瘤病理分级的Ⅰ期中的表达显著低于Ⅱ、Ⅲ期，说明恶性程度越高，表达率越高（P＜0.01）。Survivin和PTEN表达强度和阳性率与骨肉瘤的肺转移相关（P＜0.05,P＜0.01）。
表2 Survivin、PTEN和cyclinD1在骨肉瘤中的表达与临床病理特征的关系（略）
2.3 Survivin与PTEN蛋白在骨肉瘤组织中表达的相关性（表3）
由表3可见，在19例PTEN蛋白失表达的骨肉瘤组织中，Survivin全部阳性，说明PTEN的表达与Survivin的表达呈明显负相关（P＜0.01）。
2.4 Survivin与cyclinD1蛋白在骨肉瘤组织中表达的相关性（表4）
由表4可见，cyclinD1表达阳性的骨肉瘤组织中有19例Survivin表达阳性，相关系数r=0.647，P＜0.01。说明Survivin与cyclinD1在骨肉瘤组织中的表达呈显著正相关。
图1Survivin在骨肉瘤中的表达（SP ×200）（略）
图2PTEN在骨肉瘤中的表达（SP ×200）（略）
图3CyclinD1在骨肉瘤中的表达（SP ×200）（略）
表3 Survivin与PTEN蛋白在骨肉瘤组织中表达的相关性（略）
表4 Survivin与cyclinD1蛋白在骨肉瘤组织中表达的相关性（略）
3 讨论
骨肉瘤为最常见的原发于骨组织的恶性肿瘤，好发于青少年，易发生早期肺转移，预后较差，是严重危害青少年健康的恶性肿瘤之一。随着分子生物学理论和技术水平的提高，尤其是肿瘤分子生物学的，骨肉瘤的发生机理在分子水平上有了一定的认识。
Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的一个新成员，由Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体1（effector cell protease receptor 1，ECPR1）的cDNA从人类基因文库中筛选出来，基因全长15 kb，位于染色体17 q 25，含有4个外显子和3个内含子，该基因编码一个142个氨基酸的蛋白，是目前人类IAPs家族中研究最多的一个成员。它可通过细胞周期依赖激酶（CDK）调解凋亡，也能通过抑制Caspase的活化来抑制凋亡，也可通过阻止凋亡诱导因子的释放和线粒体中细胞色素C的释放在凋亡过程中起着极为重要的作用。它还与肿瘤的血管生成及微管结构的稳定等密切相关。抑制Survivin的表达可以增强Caspase?3的活性引起凋亡并可增强细胞对化疗药物的敏感性〔1〕。
本研究结果显示，Survivin在骨肉瘤中呈高表达（62.5%），显著高于其在骨软骨瘤中的表达（10%），且肿瘤恶性程度越高、分化程度越低，其表达率越高，差异有显著性。与国内其他学者研究结果基本一致，如聂涛等〔2〕研究发现，Survivin在骨肉瘤中的阳性表达率为63.1%，与Ennecking外科分期及WHO组织学分型有相关性，而在正常骨组织中未见表达。提示Survivin对骨肉瘤的发生、发展、转移以及侵袭等有一定的促进作用。Trieb等〔3〕研究发现，Survivin可以单独作为骨肉瘤患者判断预后的一个标记物。
PTEN（phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten）基因位于10 q 23，是近年来发现的具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，能使磷酸化的Tyr、Ser、Thr去磷酸化，通过去磷酸化作用而发挥抑癌功能。PTEN基因编码的蛋白具有磷酸酯酶的特征和作用，可负向调节P13K／Akt信号通路，对抗P13K途径传导的生长和生存信号，抑制肿瘤的发生和发展。肿瘤组织中PTEN基因突变导致其磷酸酶活性剧降，肿瘤细胞恶性增殖能力增强〔4〕。PTEN基因在不同肿瘤组织中突变率的差异可能与不同组织类型有关。有研究表明，PTEN在神经胶质瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、肺癌等多种恶性组织中表达下降，但在骨肉瘤中的表达情况报道较少。Levme等报道，在犬的骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中都可看见PTEN蛋白表达下降〔5〕。本研究结果表明，PTEN蛋白在骨肉瘤与骨软骨瘤中阳性表达率与染色强度的差异均有显著性（P＜0.05），提示PTEN蛋白在骨肉瘤中表达下降，从而失去对细胞周期的负调控功能，细胞异常增殖，导致肿瘤的发生。并且，PTEN还与骨肉瘤肺转移有显著相关性（P＜0.01）。本研究还发现，Survivin与PTEN在肿瘤中的表达存在明显负相关（r=-0.532，P＜0.01），表明PTEN可能通过负向调节P13K／Akt信号通路使Survivin下调，而PTEN的失活使得Akt活化，引起Survivin上调，抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤的发生、发展、肿瘤血管生成和肿瘤转移。
细胞周期分子生物学研究进展表明，癌变信息通常存在并集中于G1期，细胞将癌变时其增殖能力增强。cyclinD1是G1期细胞增殖信号的关键蛋白，本组研究结果显示，骨肉瘤中cyclinD1呈过渡表达（80.0%），其阳性率显著高于骨软骨瘤。提示该肿瘤细胞处于过渡增殖和旺盛分裂状态，这符合恶性肿瘤细胞的一般特征。据此，cyclinD1表达状态可以作为反映骨肉瘤细胞增殖能力和程度的辅助诊断指标之一。研究结果还显示，cyclinD1与Survivin的表达呈显著正相关（r=0.647,P＜0.01），提示Survivin对细胞凋亡的抑制，使得cyclinD1过表达，可使细胞持续增殖，导致癌的发生。Conway等〔6〕的实验证实，处于S期细胞的Survivin mRNA提高6.2倍，G2期Survivin mRNA提高40倍，进一步证实与细胞分裂、增殖密切相关。
Survivin与PTEN、cyclinD1基因在骨肉瘤的发生、发展中起着不同程度的作用，它们的检测对骨肉瘤恶性程度的判定、预后分析和进一步提供有效的依据，但它们的具体机理还有待于进一步深入研究。
【】
〔1〕 Chakravarti A,Zhai GG,Zhang M,et al.Survivin enhances radiation resisitance in primary human glioblastoma cells via caspase?independant mechanisms［J］.Oncogene,2004,23（45）:7494?7506.
〔2〕 聂涛,戴闽，宗世璋.Survivin 在骨肉瘤中的表达及其与血管内皮生长因子的相关性研究［J］.矫形外科杂志,2005,13（9）:683?685.
〔3〕 Trieb K,Lehner R,Stulnig T,et al.Survivin expression in human osteocarcoma is a marker for survival［J］.Eur J Surg Oncol,2003,29（4）:379?382.
〔4〕 Pennisi E.New tumor suppressor found?twice［J］.Science,1997,275（5308）:1876?1878.
〔5〕 Levine RA,Forest T,Smith C.Tumor suppressor PTEN is mutated in canine ostecsarcoma cell lines and tumors［J］.Vet Pathol,2002,39:372?378.
〔6〕 Conway EM,Pollefeyt S,Comelissen J,et al.Three differentially expressed Survivin cDNA variants encode proteins with distinct anti?apoptosis function［J］.Blood,2000,95:1435?1442.
