软骨组织工程种子细胞源的研究进展

                  作者：王翠芳，冯万文，武天佑 ，孙正义

【关键词】  软骨组织工程种子细胞源

　　多种原因造成的关节软骨病变比较常见，软骨损伤后缺乏自愈能力，软骨缺损的修复一直是临床的难题。随着细胞生物学和材料的迅速，应用组织工程学技术修复软骨病损已成为可能，而优化种子细胞源是应用这一技术的前提和关键［1］。本文就有关软骨组织工程种子细胞源的优化获取、存在的问题及其解决等研究进展作一综述。
   
　　1  软骨组织工程对种子细胞源的要求
   
　　组织工程软骨的种子细胞应符合下列要求：来源丰富，取材方便；有较强的增殖传代能力；与载体材料接种后能保持增殖能力和较高的黏附率，植入受区后能保持修复组织的表型；对机体或供区损伤小，临床应用的生物安全性和无明显的免疫排斥和其他潜在危险［2］。
   
　　2  软骨组织工程的种子细胞源

　　2.1  自体软骨细胞
   
　　理论上讲自体软骨细胞是软骨组织工程最理想的种子细胞源，不仅功能相同，不存在免疫排斥反应，而且不需要诱导分化培养。但研究表明种子细胞浓度为(5～6)×107/ml时，形成的新生软骨形态最佳，但是自体软骨组织取材受限，软骨细胞增殖能力低，难以达到应有的细胞数量，体外培养扩增容易发生去分化而失去原有的表型［3］，因此直接源于自体软骨组织的种子细胞，体外单层培养难以获取大量的细胞以满足组织工程对种子细胞的需求。
   
　　为解决上述难题，使用生物反应器三维培养可使软骨细胞快速扩增，建立能够长期培养、表型稳定的永生化软骨细胞。生物反应器能控制pH、机械能力、营养供给条件等，为细胞的生长、分化提供最适宜的环境。根据自体软骨细胞培养所需的条件，仿生性地设计接近体内环境的软骨生物反应器，模拟了体内的细胞外基质微环境。相同容积的生物反应器比普通培养方式，多出数10倍甚至上100倍的细胞。可减少细胞去分化现象，有利于细胞表型的维持，提高种子细胞的质量。有利于软骨细胞的培养、扩增及表型维持。

　　2.2  同种异体软骨细胞
   
　　与体内其他组织相比，软骨有其独特的结构和免疫学特点。软骨无血管、淋巴管和神经，细胞包埋在由软骨基质形成的软骨囊内，可阻挡免疫细胞直接与其接触，不易被机体免疫系统攻击，软骨基质抗原性低，一般不引起或仅有轻微的免疫反应，获取种子细胞时要经过消化分离和体外培养等一系列处理，软骨细胞表面抗原可被进一步消弱。同种异体软骨来源广，易获取，一次可获取大量软骨细胞，所以同种异体软骨是值得研究的种子细胞来源［５］。应用同种异体软骨细胞作种子细胞，在具有免疫力动物体内形成同种异体工程化软骨，并用于软骨缺损修复的实验报道，未发现明显的免疫排斥反应［6］。研究表明胚胎来源的软骨细胞较成体软骨细胞引起的异体排斥反应微弱，提示在同种异体软骨组织工程中，胚胎来源的软骨细胞作为种子细胞是最佳选择［７］。对同种异体软骨细胞生物学特性和相关免疫反应问题的进一步研究，将为建立软骨组织工程种子细胞库奠定基础。

　　2.3  骨髓间充质干细胞(bone marrow?derived mesenchymal stem cells，BMSCs)
   
　　骨髓中存在具有向多种细胞系分化潜能的BMSCs。Friedenstein发现骨髓中存在少量可以贴壁繁殖的BMSCs，条件培养液诱导可分化成为软骨细胞。Cancedda等［8］对BMSCs和骨膜细胞修复兔股骨髁软骨全层缺损进行了比较，发现两者均能形成软骨和软骨下骨。
   
　　Butnariu?Ephrat等［9］用BMSCs复合聚合物支架，自体和异体移植修复股骨负重区软骨缺损，结果自体BMSCs早期形成类透明软骨，异体BMSCs的免疫反应导致后期纤维化和骨关节炎改变。Gao等［10］分别用成骨和成软骨条件培养液诱导培养大鼠BMSCs，复合不同材料的双层支架植入裸鼠背部皮下，术后1周检测新生组织中含有Ⅰ、Ⅱ型胶原，认为BMSCs在不同生物活性因子的作用下，结合相应的生物材料可以构建出工程化的骨软骨复合体，因此，目前认为BMSCs是一种比较理想的种子细胞源。尽管BMSCs只有较强的增殖能力和多向分化潜能性，但其数量在全骨髓中仅占1／10５～1/10４，并且随传代次数的增加，其软骨分化潜能逐渐降低，必须通过适当的控制条件和诱导因素，使BMSCs保持增殖并分化为软骨细胞，也有研究表明重症骨关节炎病人BMSCs的成软骨能力明显降低［11］，并且最近研究证实当BMSCs培养传代90次后细胞发生癌变，声称这符合肿瘤细胞源于干细胞的假说，因此对BMSCs应用的生物安全性必须引起高度重视和深入研究［12］。

　　2.4  BMSCs与软骨细胞共培养
   
　　基于BMSCs和软骨细胞均不能完全满足组织工程对种子细胞的要求，那么将2种细胞优势互补，进行共培养来优化和扩大软骨组织工程的种子细胞源就成为可供选择的方式。Tsuchiya等［13］用不同比例的人BMSCs和牛软骨细胞共培养发现，BMSCs数量比例愈高软骨细胞表达的Ⅱ型胶原和糖胺多糖愈高，并且能保持共培养前的细胞比例，因此BMSCs能促进软骨细胞的增殖和基质形成，其原因是共培养系统中BMSCs分泌的活性生长因子(TGF)，通过软骨细胞介导自分泌或旁分泌上调了软骨细胞基质的合成。Goldberg等［14］用添加TGF β的培养基培养去分化的软骨细胞，结果表明添加TGFβ能使去分化的软骨细胞重新分化，从而维持了软骨细胞的表型。在构建工程化软骨组织中，利用BMSCs增殖能力强的特点，少量软骨细胞的微环境能诱导BMSCs分化为软骨细胞，比单纯软骨细胞构建的软骨组织更为成熟，也避免了软骨细胞长期培养传代而导致的老化和去分化，并且节省了软骨细胞的用量。因此BMSCs和软骨细胞共培养对优化和扩大种子细胞源可能是一种实用的策略。

　　2.5  软骨膜细胞或骨膜细胞
       
　　骨膜和软骨膜生发层含未分化的间充质细胞，在低氧张力、无血供的关节腔内分化为软骨细胞、关节滑液和使用CPM是促使间充质细胞向软骨细胞分化的有利因素。Wakitani等［15］培养兔胫骨膜细胞，修复兔股骨髁全层软骨缺损，24周时软骨下骨完全形成，新生软骨组织无骨化现象。Chu等［16］用异体肋软骨膜细胞和PLA支架修复兔股骨髁软骨缺损，96％的缺损6周时为软骨填充，Ⅱ型胶原比例随时间延长而升高，说明关节内环境刺激新生组织向透明软骨方向发展，黏多糖含量12个月时降低，软骨下骨厚度为正常的50％，认为异体移植的免疫反应和PLA降解产物的酸性环境影响了软骨下骨结构的形成，导致新生软骨生物力学性能下降和纤维化。

　　2.6  肌肉源性基质干细胞(muscle?derived stromal cells)
   
　　Pate等［17］使用冻融方法和地塞米松诱导培养兔肌源性基质干细胞，形成了软骨结节和含有硫酸黏多糖的细胞外基质。青年和老年人的肌细胞经诱导培养出现同样的结果［18］。Adachi等［19］用关节软骨细胞或肌源性干细胞复合II型胶原凝胶修复兔股骨髁软骨缺损区，24周后可见缺损区呈软骨样修复，优于不含细胞的I型胶原凝胶对照组，认为肌源性干细胞取材方便，细胞倍增时间短，可以作为修复软骨损伤的种子细胞源和基因的靶细胞。

　　2.7  脂肪源性基质干细胞(adipose tissue?derived stromal cells，ADSC)
   
　　为提供更多间充质细胞的自体组织，Erickson等［20］用Ⅰ型胶原酶消化人吸脂术中的皮下脂肪，经梯度密度离心获取基质干细胞，使用普通和软骨诱导培养液(含TGF?β1和地塞米松)三维培养2周后植入裸鼠背部皮下4～12周取材，免疫组织化学和RT?PCR检测表明：软骨诱导培养液体外培养1周和植入裸鼠体内的标本均有明确的成软骨特征，而使用普通培养液的对照组则阴性，类似结果亦见于大鼠脂肪来源的干细胞［21］。源于脂肪组织的基质干细胞，因脂肪组织在体内广泛存在，取材方便，对人体造成的创伤相对较小，是目前获取种子细胞的新途径，也是研究的热点，其细胞表型与BMSCs非常相似，均表达CD29、CD44、CD90、CD105，且缺少HLA?DR及C?kit表型，同时其增殖能力优于BMSCs［22］。然而Hui等［23］在修复软骨缺损的研究发现，在相同的实验条件下其修复效果不如BMSCs。由于该细胞为诱导性干细胞，体外培养时必须在持续诱导条件下才能分化为软骨细胞，培养难度相对较大并且其成软骨机制尚不完全清楚。如能掌握脂肪组织基质干细胞的成软骨机制和性能，在体外培养持续向软骨细胞分化，则不失为一种优秀的种子细胞源［24］。

　　2.8  胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)
   
　　胚胎干细胞来自早期胚胎的内细胞团或尿生殖嵴，胚胎干细胞是全能干细胞，可分化为3个胚层的细胞，种植于体内可形成包含三胚层细胞的畸胎瘤。改变体外培养条件，可使胚胎干细胞向不同的细胞系分化，报道胚胎干细胞在BMP?2和BMP?4的作用下可分化为软骨细胞［25］，胚胎干细胞与已分化的成熟软骨细胞相比，除具有更强的增殖能力外，还具有再生潜能，可维持整个生命过程中细胞的更新和正常的功能，因而胚胎干细胞作为种子细胞可能更为优势。但使用胚胎干细胞作为组织工程的种子细胞，体外培养要求严格，自发分化难以控制，分化多具致瘤性，安全性难于把握，临床使用尚存在伦问题。
   
　　3  基因修饰的种子细胞
   
　　多种细胞因子有促进软骨修复的作用。通过基因重组技术，将细胞因子基因导入软骨细胞或相关细胞，使之在病损部位分泌生长因子并维持所需的浓度和时间，有效促进软骨的修复，这就是基因修饰的组织工程技术(gene modified technology)。如TGF、IGF、EGF、GF等均可刺激软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原与蛋白多糖的合成。绿色荧光蛋白基因转染软骨细胞可标记软骨细胞的示踪。研究表明，在骨形态发生蛋白-2和BMP-4的调控下，可在体外诱导ES细胞向软骨细胞分化，同时保留其分泌Ⅱ型胶原等的特性。Sellers等［26］用含rhBMP?2的I型胶原海绵修复兔膝关节软骨缺损，24周时新生软骨厚度达到正常软骨的70％和潮线形成，rhBMP?2组与单纯胶原海绵和旷置组间的差异只有统计学意义，但是外源性生长因子半衰期短，需较大剂量或连续给药才能发挥作用，增加了治疗成本。Baragi等［２７］以腺病毒携带lacZ作为报告基因，人白介素-1受体拮抗物(hIL-1ra)cDNA作为治疗基因，用骨关节炎软骨标本体外培养软骨细胞和小软骨薄片，结果表明转染hIL-1ra基因可抑制IL-1引起的软骨基质变性，认为基因修饰后的软骨细胞表现出更强的生物学功能，在一定程度上弥补了自体软骨细胞供量不足的缺陷，缩短体外培养时间，更好地维持其表型。

   
　　多项研究表明以腺病毒、逆转录病毒或脂质体等作为载体，转染软骨细胞、骨膜细胞或直接注入病变部位是可行的，基因工程技术应用于组织工程领域可以使转染的细胞持续、稳定表达促进软骨修复的生长因子，但病毒类载体潜在的致畸性、免疫源性以及脂质体对种子细胞的毒性和转染率低等尚需进一步改进。
   
　　4  展望
   
　　种子细胞是构建组织工程化软骨和应用研究中的首要环节和基本要求，也是保证软骨组织工程学持续性深入研究的前提。影响优化软骨种子细胞源的因素众多，目前研究的种子细胞各具优缺点，尚没有一种细胞能够完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求，今后需要开发和挖掘更多的种子细胞源，并在模拟体内的微环境中进行培养，建立种子细胞的评价系统，优化出理想的种子细胞，为软骨组织工程的研究和临床应用提供可靠保证。BMSCs相关研究和技术比较成熟，今后的研究重点是如何保证细胞能在特定的时间内定向扩增到临床所需的数量，并避免致瘤性的产生。BMSCs和软骨细胞共培养可能为解决上述问题提供了一种实用的策略，但两种细胞间的相互作用机制尚需进行深入研究。目前脂肪基质细胞和胚胎干细胞的临床应用研究相对滞后，但随着技术的不断，对其成软骨机制和性能也会不断了解，优势会逐渐显现。当然，种子细胞的优化只是软骨组织工程学研究的第一步，今后还要解决细胞所需载体及细胞与载体相容性及相互作用等问题，当最终运用到临床尚需考虑免疫排斥性问题。

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