兔骨髓基质干细胞体外培养复合β－磷酸三钙进行胸椎后侧融合实验研究
作者：许卫兵 贾连顺 卢建熙 卢旭华 滕红林 顾宇彤 杨建东 陈长青
【关键词】 脊柱融合
摘要：［目的］评价β－磷酸三钙复合骨髓基质干细胞为骨移植替代物进行脊柱融合的效果。［方法］60只兔子分四组进行胸椎后路融合：Ⅰ组（组织工程化骨即β－TCP复合BMSCs），Ⅱ组（β－TCP＋自体红骨髓），Ⅲ组（单纯β－TCP），Ⅳ组（自体髂骨）。术后12周处死其余动物进行放射学、手工力学和组织学检查。［结果］从影像学和手工力学比较，Ⅰ组的融合率高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组且有统计学差异。组织学上，Ⅰ组新骨形成量较多，陶瓷微孔内部充满新生骨;Ⅱ组骨小梁形成量较Ⅰ组少, 为新生骨与纤维组织混杂；Ⅲ组陶瓷骨颗粒微孔内多为结缔组织，新生骨的量少，只见少量新生骨贴附于陶瓷骨表面; Ⅳ组在椎板与移植骨的交界处有稀疏的新生骨小梁形成。［结论］β－TCP复合BMSCs是脊柱融合自体骨的良好替代物。
关键词：骨髓基质干细胞；β－磷酸三钙；脊柱融合；骨移植替代物
Bone marrow stromalderived osteoblastsporous βtricalcium phosphate composites as bone graft substitute for posterior thoracic spinal fusion
Abstract：［Objective］To evaluate the efficacy of autogenous bone marrow stromalderived osteoblastsporous(BMSCs) βtricalcium phosphate(βTCP) composites as an alternative to autogenous graft materials in spinal fusion.［Method］Posterior thoracic spine fusion was carried out in 60 White New Zealand rabbits using one of the following graft materials:βTCP granules plus cultured MSCs(group Ⅰ);β－TCP granules plus fresh autogenous bone marrow(group Ⅱ); β－TCP granules alone(group Ⅰ); and autogenous bone graft(group Ⅳ). All the rabbits were killed 12 weeks after surgery to evaluate with radiography, CT, manual palpation and histologic analysis.［Result］The rate of fusion was significantly higher in group Ⅰ compared with group Ⅱ, group Ⅲ and group Ⅳ; In group I histological analysis showed abundance newly formed bone in contact with the implanted granules;In group Ⅱ there were a reduced amount of newly formed bone and abundant fibrous tissue; In group Ⅲ there were relatively little new bone formation and abundant fibrous tissue; In group Ⅳ, there were thin trabeculae of newly formed bone closed to the decorticated lamina and some fibrous tissue.［Conclusion］The results indicate that bone marrow stromalderived osteoblastβ TCP composites may provide an well alternative to autogenous graft materials for spinal fusion.
Key words：Bone marrow stromal cell; βtricalcium phosphate; Spinal fusion; Bone graft substitutes
脊柱融合材料的研制及生物学因素在脊柱融合的过程中所起的作用已引起广泛重视，本实验探讨应用多孔陶瓷β磷酸三钙（βTCP，上海贝奥路生物材料公司）复合培养骨髓基质干细胞(BMSCs)进行脊柱融合，以期达到良好的脊柱融合率，寻找更理想的脊柱融合骨移植替代材料。
1 材料和方法
1.1 骨髓基质干细胞体外培养和诱导分化
将穿刺抽取的兔骨髓细胞液在1h内进行接种培养。按3×105/cm2的密度接种于DMEM液培养瓶中，于37℃，5%CO2培养，5d后换液，去除未贴壁细胞，加入含成骨细胞诱导液的DMEM培养基进行诱导培养，使其向成骨细胞转化。以后每隔3d换液。细胞生长达融合80％～90％后，用0.25%胰蛋白酶进行消化，计数。按1∶3～4进行细胞传代。收集第三代细胞备用。
1.2 载体（βTCP）的准备
将βTCP人工骨制备成5mm3大小，用三蒸水在超声清洗机上反复清洗，洗净其表面及孔隙中的碎屑，干燥后环氧乙烷消毒无菌包装备用。
1.3 组织工程骨的构建
将βTCP人工骨颗粒浸在纤维连接蛋白（100mg/ml）溶液中，4℃条件下放置16h；然后换成DMEM培养基，并取传第三代的骨细胞，以（5～10）×106/ml的浓度与βTCP混合，在37℃，5%CO2培养条件下用摇床动态培养24h，其中复合培养12h换液1次。然后同等条件下改静态培养，体外培养3～5d。制备组织工程化人工骨复合物。
1.4 脊柱融合动物分组和手术方法
1.4.1 动物分组
60只兔子分4组进行胸椎后路融合：Ⅰ组（组织工程化骨即βTCP复合BMSCs），Ⅱ组（βTCP＋自体红骨髓），Ⅲ组（单纯βTCP），Ⅳ组（自体髂骨）。将拟植入的βTCP人工骨粒浸在纤维连接蛋白（100mg/ml）溶液中，4℃条件下放置16h。Ⅰ组：植入βTCP复合骨髓基质细胞。Ⅱ组：植入βTCP＋新鲜自体骨髓(每侧5ml，共10ml/只)。Ⅲ组：植入单纯βTCP。Ⅳ组：植入自体髂骨皮质松质骨颗粒。植入材料均为5g。
1.4.2 手术方法
兔耳静脉苯巴比妥钠35mg/kg麻醉。剃毛、固定、消毒。胸椎后正中切口，显露双侧椎板和关节突关节；去除椎板小关节上软组织，并将椎板、小关节皮质骨打毛，刮勺刮去关节间隙部分软骨。每侧放置2.5g植骨材料。逐层缝合。术后分笼饲养。肌注青霉素80μm/d，共5～7d。
1.5脊柱融合的评价方法
1.5.1 X线片结合CT平扫及三维重建评估融合情况
按照Curylo［3］的分级标准评分, 3、4分时诊断为坚固融合； 2分、2分以下时诊断为假关节形成。由2名有经验的医生用双盲法进行评估。
1.5.2 非破坏性手工力学检测
取出整块胸椎标本，修剪标本长度为融合节段加上下各1个椎体，保留上下各一节段正常未做融合节段的目的是做为融合节段力学检测的对比。剔除周围肌肉组织，去除前方椎体及保留各韧带后方椎板，关节突关节、横突，手工力学检测，评价融合情况。
1.5.3 组织学分析
将上述力学检测的标本用4％福尔马林固定24h，脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色。光镜下观察。
1.6 统计学分析
用SAS6.12软件非参数检验做统计学分析。当P＜0.05时，为有显著性差异。
2 结果
2.1 动物一般情况
术后2d内死亡4只,及时补做实验;其余动物未见不良反应。
2.2 标本大体观察
剔除骨周软组织，植骨材料周围未见炎症现象。Ⅰ组较Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组融合骨块体积大；在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组融合块的外面可以看到不同程度的陶瓷颗粒嵌于融合块中，Ⅰ组和Ⅱ组标本的陶瓷颗粒与周围组织粘附较紧密，而Ⅲ组中陶瓷颗粒易于从周围组织中剥离。
2.3 影像学观察
在X线片和CT平扫及CT三维重建上观察融合骨块，有以下特点： Ⅰ组的骨块形成量相对较大、植骨与椎板融合界面及质地均匀度均好于其它各组(图1～4)。按照Curylo［3］制定客观分级标准,4组之间坚固融合的百分比有显著性差异（P=0.0324）;Ⅰ组的融合率高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05）(表1) 。表2 手工触诊力学检测融合情况组别 （略）
2.4 手工力学检测
按Boden［4］的分级标准。Ⅰ组大部分获得坚固融合；Ⅲ组和Ⅳ组未融合标本形成率均接近50％，而坚固融合的比率相对低。Ⅰ组未融合比率明显低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组（P<0.05），有统计学意义；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3组之间无显著性差异(表2)。表1 放射学评分组别 （略）
2.5 组织学观察
Ⅰ组：整个融合骨块的陶瓷骨微孔内全部充满新生骨，中央有血管形成，无纤维结缔组织（图5）。Ⅱ组：融合骨块的陶瓷骨微孔内为新生骨和纤维结缔组织，新生骨的量明显少于Ⅰ组（图6）。Ⅲ组：与Ⅰ、Ⅱ组相比，陶瓷骨颗粒微孔内多为结缔组织，新生骨的量少，只见少量新生骨贴附于陶瓷骨表面（图7）。Ⅳ组：12周时，自体骨与椎板达到愈合，但骨小梁稀疏，没有再血管化的倾向（图8）。
3 讨论
自体移植骨能够为新骨形成提供必要的材料包括骨形成细胞、生长因子以及支撑骨细胞和细胞间基质的支架结构。但是自体骨移植尚有某些不足之处，难以普遍推广应用。寻找自体骨替代材料的研究已有多年［1］,尚无一致的结论 。一些研究认为具有骨传导作用的材料单独应用于脊柱后外侧融合时不能获得较高的融合率［2］。加上具有骨诱导作用的物质特别是BMP家族，比单用具有骨传导作用的材料能获得明显高的融合率［1］。然而，BMP费用昂贵和可能引起异位骨化等副作用限制了其临床应用，况且BMP在临床试验性应用中没有获得比单独应用自体移植骨［5］或脱钙骨基质更好的融合效果［6］。但也有动物实验表明BMSCs+BMP较新鲜红骨髓有更快、更强的成骨能力［7］。寻找更好的植骨融合材料是目前骨组织工程研究的热点。
BMSCs有多向分化潜能，在体外一定的诱导条件下可以扩增分化为成骨细胞并分泌细胞因子；βTCP陶瓷骨具有良好的生物相容性、孔隙率和机械性能，且能降解，是骨组织工程的良好载体。本实验研究表明用βTCP复合培养BMSCs进行脊柱融合比单独应用βTCP获得明显高的坚固融合率，并且有比自体骨融合率更高的趋势。βTCP可能影响放射学评分，在X线片和CT均表现出有连续性骨块，但组织工程化骨组比单纯应用βTCP组似乎更均匀同质并且植骨与椎板连接更紧密。这个结果在大体标本上也能证实：单独应用βTCP进行融合动物的融合块中，其陶瓷颗粒容易从融合块周围组织中剥脱，而应用βTCP复合BMSCs或加入新鲜骨髓进行融合的融合块中，其陶瓷颗粒不容易从周围组织中剥脱。
已经有很多研究通过长骨缺损的动物模型证实了新鲜骨髓的骨诱导作用, 然而当新鲜骨髓被用于脊柱后外侧融合时，其结果争议很大［1，3］。本研究表明，用βTCP复合BMSCs进行融合，其融合率比应用简单机械混合新鲜骨髓的βTCP融合率高，并且组织学分析I组中新生骨的量明显比Ⅱ组多。
本实验研究证实BMSCs经过体外刺激分化为骨祖细胞后可以种植到βTCP陶瓷骨上，这种复合材料在脊柱融合实验研究中可以促进新骨形成，其融合效果明显好于单纯βTCP陶瓷骨材料。
：
［1］Boden S D， Martin G J Jr，Morone M，et al.The use of coralline hydroxyapatite with bone marrow, autogenous bone graft, or osteoinductive bone protein extract for posterolateral lumbar spine fusion［J］.Spine,1999,15;24(4):320-327.
［2］Itoh H， Ebara S，Kamimura M，et al. Experimental spinal fusion with use of recombinant human bone morphogenetic protein 2［J］. Spine,1999，15;24(14):1402-1405.
［3］Curylo LJ,Johnstone B,Petersilge CA,et al.Augmentation of spinal arthrodesis with autologous bone marrow in a rabbit posterolateral spine fusion model［J］.Spine，1999，5:434-438.
［4］Boden SD， Schimandle JH,Hutton WC.An experimental lumbar intertransverse process spinal fusion model. Radiographic, histologic, and biomechanical healing characteristics［J］.Spine,1995,15;20(4):412-420.
［5］Friedlander GE, Clayton RP, Cole DJ,et al. Osteogenic Protein1(BMP7) in the treatment of tibial nonunions［J］.J.B.J.S.（Am），2001，83:151-１５8.
［6］Geesink RG，Hoefnagels NH，Bulstra SK.Osteogenic activity of OP1 bone morphogenetic protein (BMP7) in a human fibular defect［J］. J Bone Joint Surg(Br)，1999，81(4):710-718.
［7］常红星，李亚非，时旭山，等.兔自体骨髓基质干细胞经皮移植修复骨缺损的实验研究［J］. 矫形外科杂志，2004，12：925-926.
