胚胎脊髓不同移植方法对损伤后大鼠脊髓轴突再生的作用

【关键词】  脊髓损伤

    摘要：［目的］研究胚胎脊髓不同移植方法对损伤后大鼠脊髓轴突再生的作用。［方法］将成年大鼠分为四组，A组：单纯脊髓挫伤和半切洞组；B组：脊髓挫伤和半切洞+胚胎脊髓移植组；C组：脊髓挫伤和半切洞+胚胎脊髓移植+损伤区上下神经根吻合组；D组：脊髓挫伤和半切洞+胚胎脊髓移植+带蒂大网膜移植组。移植后6周，应用行为学检查，观察大鼠功能恢复情况，用光、电镜检查轴突和观察轴突病理变化，采用计算机图像分析技术，进行定量分析。［结果］作者发现脊髓损伤后6周A组轴突丢失最严重，各组轴突都有不同程度的减少，其减少程度顺序是A组>B组>C组>D组。D组与其它三组比较有显著差异性。残留的轴突数目与神经功能的改善相平行。［结论］大鼠胚胎脊髓和大网膜移植后能增强损伤脊髓轴突再生并能促进大鼠后肢神经功能的恢复。

　　关键词：脊髓损伤；胚胎脊髓移植；大网膜；脊神经根；轴突；形态学分析

　　Effect of different methods of fetal spinal cord tissue transplantion on axon regeneration after spinal cord hemisection

　　Abstract：［Objective］To investigate the effect of different methods of fetal spinal cord (FSC) tissue transplantion on quantitative analysis of axon regeneration after spinal cord injury (SCI).［Method］Forty  rats were divided into four groups: the weightdrop contusion and hemisection injury group (group A),Fetal spinal cord (FSC) transferred group (group B),FSC transferred into SCI site with upper and lower spinal nerve roots anastomosis group (group C) and FSC with the pedicle omentum transferred into the weightdrop contusion and hemisection cavity group (group D).After operation 6 weeks,light and electron microscope were used to examine axonal pathology,open field and inclined plane tests were examined.Axons counts were quantitated by a computer image analysis system.［Result］More loss of axons was seen in group A than any other groups,at 6 weeks postoperatively. The reduce rate sequence of loss of axons was found in all four groups, will group A>B>C>D(P<0.05).This increase in remained axons were correlating with a significant improvement in neurological function recovery.［Conclusion］FSC with pedicle omentum transplanted after SCI enhance axon regeneration  in the white matter，and can promote the recovery of neurological function.

　　Key words：Spinal cord injury; Intraspinal graft;Fetal spinal cord;Omentum;       Spinal nerve roots; Axon;Morphometric analysis

　　脊髓损伤后轴突损伤和脊髓白质上行和下行通路的丢失是感觉、运动功能缺失的主要原因。大鼠脊髓不完全横切实验研究表明保留或减少5%~10％的白质将意味着明显的功能恢复或永久性的瘫痪［1，2］。目前，作者对脊髓损伤后胚胎脊髓移植功能恢复与轴突再生数量的关系了解较少，本实验应用胚胎脊髓不同的移植方法观察对损伤后大鼠脊髓轴突再生的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组

　　Wistar大鼠40只，体重220～250g，雌雄不拘。每组10只动物。随机将动物分为：A组：单纯脊髓挫伤和半切洞组；B组：脊髓挫伤和半切洞+胚胎脊髓移植组；C组：脊髓挫伤和半切洞十胚胎脊髓移植+损伤区上下神经根吻合组；D组：脊髓挫伤和半切洞+胚胎脊髓移植+带蒂大网膜移植组。手术后6周，实验动物经麻醉后，用生理盐水(0．9％)、4％多聚甲醛(pH 7．4)做心脏灌注固定。取脊髓全长，对损伤区以及上、下端1cm的脊髓组织做20μm的冰冻切片，进行光、电镜检查观察大鼠胚胎脊髓移植后损伤脊髓轴突病理的变化，电镜检查包括三个节段的切片，切片组织为脊髓腹侧正中白质1575μm2的特定区域，轴突计数用计算机图像分析系统进行图象处理。用斜板试验和Tarvol评分观察神经功能。

　　1.2 胚胎脊髓移植物的制备

　　用怀孕14d的大鼠的胚胎脊髓为移植物，将其麻醉，用无菌技术在显微镜下取出胚胎脊髓1～2mm3放在人工脑脊液中，准备做移植用。

　　1.3  移植方法

　　用戊巴比妥钠30mg／kg腹腔内注射麻醉，腰背部脱毛，将大鼠固定在立体定位仪上，做T12～13全椎板切除，无菌条件下暴露脊髓腰膨大。用10g重物从2．5cm高落下造成中度脊髓挫伤，然后用负压吸引的方法吸除左侧半坏死脊髓造成一约2mm×1mm×1mm大小的洞腔。脊髓挫伤和半切洞后，A组仅做脊髓挫伤和半切洞，并用同样大小的明胶海绵填充脊髓洞腔。B组应用胚胎脊髓移植，用无菌玻璃管吸取约2mm×1mm×1mm胚胎脊髓注入预制的脊髓洞腔内，C组胚胎脊髓移植后经腹膜后间隙暴露脊髓左侧T12和L1神经根用显微外科剪切断之，然后用硅胶管套接吻合T12和L1近端。D组取腹部正中切口从脾和胃大弯纵行游离大网膜，有时须将脾切除，将大网膜从左侧腹壁引出经皮下隧道转移到腰背部切口内，将大网膜末端覆盖移植的胚胎脊髓。然后用90线缝合硬脊膜，并将蒂与硬脊膜缝合固定，注意尽量保持大网膜血运。然后，用90线缝合硬脊膜，逐层缝合切口。

　　1.4 斜板试验

　　斜板试验［3］测量抓握能力和维持姿势的能力即动物在斜板上维持5s不滑下的角度。

　　1.5  改良的Tarlov评分

　　改良的Tarlov评分［4］:0分：后肢没有自主性运动,不能支持体重;1分：仅有后肢可见的运动,不能支持体重;2分：后肢可见有力的运动,但不能支持体重;3分：后肢能支持体重,能行走一两步;4分：中度步态异常;5分：正常步态。

　　1.6 统计学分析

　　应用Tiger计算机图像分析系统计算轴索，采用单因数方差分析和t检验进行统计学处理。

　　2 结果

　　2.1 临床神经功能试验

　　手术后6周A组大多数动物后肢仍然瘫痪，而B组、C组和D组的大多数动物后肢已能支持体重并能行走，尤其是D组动物行走功能已基本正常，Tarlov评分也出现了同样的变化趋势。斜板试验和Tarlov评分结果见表1。表1  临床神经功能试验结果分组 （略）  

　　2.2 轴突计数

　　脊髓损伤后作者比较了各组脊髓轴索数量和轴浆、髓磷脂的异常情况，发现A组轴突再生最少，并且轴索病理变化最严重，D组轴突再生最多。正常大鼠T12～Ｌ１脊髓节段特定区域平均髓轴突计数是231±19，损伤部位有髓轴突计数见表2。表2 损伤部位轴突计数分组 （略）                            
　　3 讨论

　　在临床上急性脊髓损伤很少是横断脊髓，通常在软膜下保留200～300μm白质中少量的轴突，尽管一些研究者发现脊髓压迫伤和挫伤后残留5%~10％的轴突就能恢复一些神经功能［1，2］。然而，详细了解残留神经功能和脊髓损伤后不同胚胎脊髓移植方法保留轴突的关系将有助于了解这些方法的作用。一些作者应用形态学定量分析的方法，脊髓损伤后残留白质量发现与行为恢复有关［5，6］。这些研究表明残留白质量与临床神经功能恢复有线性关系。本实验研究的主要结果是，手术后6周A组保留了20％的正常轴突，B组保留了40％，C组保留了50％，D组保留了60％。轴突丢失率的顺序是A>B>C>D(P<0．05)，临床神经功能恢复评分的顺序是D>C>B>A(P<0．05)。残留的轴突和临床神经功能恢复有相同的变化趋势。

　　研究表明胚胎脊髓可以在宿主脊髓中存活、发育、生长、分化并形成神经连接促进功能恢复。其可能的机理有［7,8］：(1)胚胎脊髓能作为一个细胞桥的作用填充损伤区，提供化学或机械的引导，刺激脊髓神经生长，引导损伤神经再生通过损伤区；(2)胚胎脊髓能够提供神经元，补偿由于损伤破坏丢失的细胞结构；(3)胚胎脊髓能产生有益于宿主脊髓的各种因子，这些营养因子能够挽救脊髓损伤后濒死的神经元，促进神经再生。在大量动物实验基础上人胚胎脊髓移植也进入了临床应用阶段，最令人兴奋的是Falic等［9］首次将人妊娠7．5～9周流产的块状胚胎脊髓移植到长6cm的颈椎创伤后脊髓空洞中，手术后7个月MRI检查显示脊髓空洞消失，胚胎脊髓与周围组织融合良好，病人中枢性疼痛和四肢痉挛明显减轻，感觉和运动功能有不同程度的改善。以前的研究发现应用带蒂大网膜转位和胶原基质凝胶桥接猫横切的脊髓，12周后带蒂大网膜转位的猫与没做转位的动物比较增加了66％的脊髓血流量，而且，与对照组比较肾上腺素能轴突再生增加了10倍。这些发现表明大网膜移植到胶原基质桥可以增加血流量促进脊髓切断的神经纤维轴突外生［10］。研究还表明带蒂的大网膜移植后72h，在大网膜和脊髓之间就已建立血液循环，1周后完全形成血管联系，对损伤的脊髓有益［11］。另外的研究表明人类肋间神经含有大约1000～2000条运动神经纤维。在大鼠动物模型将肋间神经与腹根神经吻合有助于下肢神经功能恢复。应用硅胶管和显微外科技术将肋间神经和马尾神经吻合，手术后9个月大多数实验动物能够抬起瘫痪的下肢并能行走。神经活动诱发电位和肌活动诱发电位显示肋间神经和坐骨神经有一些功能连接。12个月后组织学分析显示轴索再生从肋间神经进入腰脊神经腹根［12］。作者的研究结果表明脊髓损伤后胚胎脊髓和带蒂的大网膜移植能够阻止白质损伤的病理进程，促进脊髓损伤后轴突的再生从而促进大鼠下肢功能的恢复。

　　：

　　［1］Blight AR．Morphometric analysis of a model of spinal cord iniury in guinea pigs with behavioral evidence of delayed secondary injury［J］.J Neurol Sci, 1991,103:156-171.

　　［2］Fehlings MG,Tator CH.The effect of direct current field polarity on recovery after acute experimental spinal cord injury［J］.Brain Res,1992,579:32-42.

　　［3］Fehlings,MG and Tator CH. The relationships among the severity of spinal cord injury,residual neurological function, axon counts, and counts of retrogradely labeled neurons after experimental spinal cord injury［J］.Exp Neurol,1995,132:220-228.

　　［4］Cheng H,Cao Y and Olson L. Spinal cord repair in adult paralegic rats: Partial restoration of hind limb function［J］.Science,1996,273:510-513.

　　［5］Behrmann DL,Bresnahan JC,Beattie MS,et al. Spinal cord injury produced by mechanical displacement of the cord in rats:behavioral and histologic analysis［J］.J Neurotrauma,1992,9:197-217.

　　［6］Rosenberg LJ and Wrathall JR. Quantitative analysis of acute axonal pathology in experimental spinal cord contusion［J］.J Neurotrauma,1997,14(11):823-838.

　　［7］Zompa EA,Cain LD, Everhart AW,et al. Transplant therapy: recovery of function after spinal cord injury［J］.J Neurotrauma,1997,14:479-506.

　　［8］Murray M,Fischer I,Smeraski C,et al.Towards a definition of recovery of function［J］.J Neurotrauma.2004,21:405-413.

　　［9］Falci S,Holtz A,Akesson E,et al.Obliteration of a posttraumatic spinal cord cyst with solid human embryonic spinal cord grafts: first clinical attempt［J］.J Neurotrauma,1997,14(11):875-889.

　　［10］De La，Torre JC, Goldsmith HS. Increased blood flow enhances axon regeneration after spinal transection［J］.Neurosci Lett,1988,94(3):269-273.

　　［11］De La， Torre JC, Goldsmith HS. Collagenomental graft in experimental spinal cord transection［J］.Acta Neurochir,1990,102:152-163.

　　［12］Zhao S,Beuerman RW,Kline.Neurotization of motor nerves innervating the lower extremity by utilizing the lower intercostal nerves［J］.J Reconstr Microsurgery,1997,13(1):39-45.