人血管内皮抑制素vasostatin120-180在大肠杆菌中的表达纯化及初步的抗血管生成活性研究

【摘要】  目的:在大肠杆菌中克隆和表达人源血管内皮抑制素vasostatin120-180（VAS）基因，并进行分离纯化及抑制新生血管生成活性鉴定。方法：根据大肠杆菌偏爱密码子,应用化学合成和分子克隆方法得到人源血管内皮抑制素120-180片段（即VAS）的编码基因。通过PCR和限制性内切酶消解，将VAS编码基因克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中，并在BL21（DE3）菌株中经IPTG诱导、表达带有His融合标签的His-VAS重组蛋白。VAS蛋白的表达水平大约占细菌总蛋白的45%，大多数目的蛋白以包涵体形式存在,经过体外包涵体变性、复性及纯化，采用SDS-PAGE分析鉴定，用鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果：经DNA序列分析鉴定，重组质粒pET28a-VAS构建成功，IPTG诱导后的融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达，Western blotting分析并鉴定了VAS的分子属性。通过鸡胚尿囊膜试验验证，重组VAS蛋白能够很好地抑制微血管生成。结论：获得高效表达的、高纯度的VAS，为VAS进一步的功能分析和抑制血管生成活性研究奠定了基础。

【关键词】  偏爱密码子; 血管内皮抑制素120-180; 包涵体; 变复性; 鸡胚尿囊膜试验

  肿瘤的生长和增殖依赖于血管生成——新血管的形成［1］。抗血管形成已经成为极有前景的癌症方法，即以肿瘤组织内部快速生长的微血管系统为靶点，而非肿瘤自身。这一策略的基本原理是：与肿瘤细胞相比，血管内皮细胞在遗传上更加稳定，在大量长时间给药情况下不易产生耐药性［2-3］。

    各种各样的血管生成抑制剂，例如endostatin［4］、angiostatin［5］、vasostatin［6］和tumstatin［7］等已经被鉴定出来，实验证明这些分子能靶向血管内皮细胞，进而阻止肿瘤生长。其中Vasostatin为钙网蛋白calreticulin N端1-180氨基酸的结构域，是一种血管生成抑制剂，在体内具有抗肿瘤效果。它能特异地抑制血管内皮细胞增殖，抑制新生血管生成，能够阻止或减慢实验性肿瘤的生长［6］。进一步研究发现，钙网蛋白抗肿瘤活性存在于120-180氨基酸的结构域中［8］，本文称之为VAS。本研究设计并合成VAS的编码基因，在大肠杆菌中实现它的高效表达，进行分离纯化，并对其抑制血管生成活性初步鉴定，旨在为今后对VAS蛋白功能的进一步研究和药物开发打下基础［9］。

    1  材料及方法

    1.1  材料

    pET28a(+)质粒,大肠杆菌Top10（本试验室保存），PCR试剂，限制性内切酶（Promega），Klenow大片段、T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA连接酶（TaKaRa），表达宿主菌BL21（DE3）（Novagen），IPTG（Sino-American Biotechnology Company），3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司)，寡核苷酸合成以及DNA测序服务（上海申能博彩生物科技有限公司），羊抗人calreticulin多抗(Santa Cruz Company)，Ni-IDA、DEAE-sepharose填料(本实验室提供)。

    1.2  方法

    1.2.1  VAS基因的克隆及其表达载体的构建  参照大肠杆菌偏爱的密码子［10］化学合成了10条寡核苷酸，寡核苷酸的长度为28～35个碱基，相邻的寡核苷酸有5～8个碱基相互配对，寡核苷酸的序列从5′到3′依次是：(1)CCGCTCGAGCATATGACTGACATGCACG GTGAC;(2)GACCAAACATGATGTTGTATTCAGAGTCAC; (3)TTTGGTCCGGACATCTGCGGCCCGGGC;(4)GAAGATTACGTGAACTTTTTTGGTGCCCGG; (5)AAT CTTCAACTACAAAGGCAAGAACGTTCTGATC; (6)G CAACGGATGTCCTTGTTTAGCAG; (7)GTTGCAAGGA TGATGAATTTACACAC;(8)ACGAACAATCAGTGTGT ACAGGTGTGT;(9)GTTCGTCCAGACAACTAATTGAA TTCC;(10)GGAATTCAATTAGTTGTCTG。它们之间的重叠模式见图 1。首先将所有的寡核苷酸稀释至100 pmol·μl-1，而后按照以下步骤依次处理：T4多聚核苷酸激酶磷酸化, 30 ℃退火, Klenow大片段补平缺口（gap），T4 DNA连接酶连接所有缺刻（nick），最后得到编码人calreticulin 120至180位氨基酸的183 bp的双链DNA片断。用PCR方法将该片断进行扩增，所用的正向引物P1为5′-CGGGATCCTGGACGACG ACGACAAGATGACTGACATGCACGGTGAC-3′，反向引物P2为5′-CCCTCGAGTCATTAGTTGTCTGGACGA ATCAG-3′。在正向引物中有一个BamHⅠ的酶切位点(黑体)以及编码肠激酶识别位点DDDDK的序列（下划线部分），反向引物中有一个XhoⅠ的酶切位点(黑体)。 PCR反应的条件为94 ℃热变性1 min, 55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共进行25个循环，流程简图见图 2。

    纯化的PCR产物采用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切,然后插入pET28a的多克隆位点。pET28a是一个T7系列的N端融合His-tag的原核表达载体。对重组表达载体pET28-VAS进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。

    1.2.2  融合蛋白His-VAS在大肠杆菌BL21中的诱导表达  将His-VAS融合蛋白表达载体pET28a-VAS转入感受态表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，挑取单克隆接种至新鲜的LB液体培养基 (含50 mg·L-1的卡那霉素)。在37 ℃待细菌长至OD600为1.0左右，加入终浓度为0.6 mmol·L-1的IPTG诱导His-VAS的表达,诱导5 h后收集菌体,处理后的菌体蛋白样品进行16.5% SDS-PAGE分析。

    1.2.3  包涵体的精制  取上述1 L发酵液离心收集菌体，每克菌体于10 ml buffer A（20 mmol·L-1 Tris-HCl，50 mmol·L-1 NaCl，1 mmol·L-1 EDTA，1 mol·L-1 urea，0.5% Triton-100，pH 8.0）重悬。在冰浴条件下充分超声破碎后，于4 ℃ 10 000 r·min-1离心15 min收集沉淀,弃上清，沉淀即为粗制包涵体。用相同体积的 buffer A重悬，超声洗涤20 min，于4 ℃ 10 000 r·min-1离心15 min,收集沉淀，将包涵体按此步骤重复洗涤3次。

    将包涵体溶解于5 ml变性缓冲液(6 mol·L-1盐酸胍，50 mmol·L-1 Tris-HCl，5 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-1 DTT，pH8.5)，置37 ℃摇床，250 r·min-1振荡4 h，12 000 r·min-1离心25 min，保留上清液，沉淀弃去。

    将上清按1∶30的比例用复性缓冲液buffer B (50 mmol·L-1Tris-HCl，1.5 mol·L-1 urea，50 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，5% glycerol，pH8.0)稀释:用恒流泵将复性缓冲液buffer B缓慢滴加到变性蛋白溶液中，整个过程在冰浴条件下进行，并用磁力搅拌器搅拌，置4 ℃冰箱24 h制成复性蛋白溶液。再以复性蛋白溶液和透析缓冲液1∶100的比例对透析缓冲液buffer C (20 mmol·L-1Tris-HCl， 50 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，5% glycerol，pH 8.0)透析，换两次透析液。最后对酶切缓冲液buffer D (20 mmol·L-1Tris-HCl， 50 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0)透析，换两次酶切缓冲液。

    将充分透析后的复性蛋白溶液用超滤器浓缩，超滤膜的截留相对分子质量为10 000。

    1.2.4  融合蛋白His-VAS的EK酶切［11］  将复性得到的His-VAS蛋白稀释至1 mg·ml-1，按照在4、16和20 ℃质量比分别为1∶5 000、1∶2 000和1∶1 000下酶切12 h，从而探索EK最适宜的酶切体系，酶切后的蛋白样品进行16.5% SDS-PAGE分析酶切结果。

    1.2.5  EK酶切后VAS的纯化  按照小量酶切分析得到的结果进行大量酶切,酶切产物进行DEAE-sepharose 4B层析、纯化VAS。

    1.2.6  VAS纯度和得率分析  将纯化得到的VAS进行16.5% SDS-PAGE，染色后采用灰度扫描分析纯度。根据目的蛋白经过每步纯化得到的相对分子质量，每步蛋白纯化的得率。

    1.2.7  鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验  为了确认VAS在活体内具有对新血管生成的抑制作用，我们进行鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验［12］。试验选用的是孵化8 d的非免鸡胚。具体做法如下：首先用小钻子在鸡胚的气室上凿一小洞，然后用小镊子将气室上方的部分蛋壳去除，进而剥去气囊膜，然后将带有不同剂量VAS（每个剂量重复7个鸡胚）的滤膜覆于尿囊膜的血管密集处，用封口膜封闭气室。将鸡胚置于37.5 ℃和相对湿度为80%～90%的培养箱中培养，48 h后用甲醇和丙酮（体积比为1∶1）的溶液固定滤膜覆盖处尿囊膜，15 min后用小剪刀剪下固定部位，用PBS洗涤，而后在解剖镜下观察血管生长情况并用数码相机拍照，无血管区域内径大于或者等于8 mm的试验结果确定为阳性。

    2.1  VAS基因的拼接及其His融合表达载体的构建

    按照方法中所述步骤，我们成功获得了密码子优化的183 bp VAS编码序列：ATG ACT GAC ATG CAC GGT GAC TCT GAA TAC AAC ATC ATG TTT GGT CCA GAC ATC TGC GGC CCG GGC ACC AAA AAA GTT CAC GTA ATC TTC AAC TAC AAA GGC AAG AAC GTT CTG ATC AAC AAA GAC ATC CGT TGC AAG GAT GAT GAA TTT ACA CAC CTG TAC ACA CTG ATT GTT CGT CCA GAC AAC TAA  TGA。将该片断克隆至His编码序列的下游,并与之处于同一阅读框。为了便于释放并纯化野生型的VAS，我们在His和VAS之间设计并加入肠激酶的酶切位点, 重组质粒经测序验证,阅读框及DNA序列全部正确，见图3、4。

    2.2  融合蛋白的诱导表达

    经SDS-PAGE分析表明，重组蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达，在37 ℃，采用IPTG诱导后延长发酵时间的方法可以较大程度地提高目的蛋白的产量，目的蛋白占菌体总蛋白的40%左右，其中95%以上的His-VAS都是以包涵体的形式存在。其相对分子质量约为14 000，与理论值相符。37 ℃诱导5 h表达结果见图5。

    2.3  融合蛋白的变复性

    收集1 L的发酵液，充分超声后离心收集得到粗制的包涵体，这时目的蛋白的纯度为80%左右。经过3次洗涤后，目的蛋白的纯度达到85%以上，1 L发酵液可以得到约120 mg的精制包涵体。经过变复性以及充分透析后，可以得到115 mg左右的重新折叠的融合蛋白，纯度在85%以上，融合蛋白的复性效率很高，达95%左右。37 ℃诱导5 h表达包涵体精制结果见图6。

    采用不同的酶∶融合蛋白比例（1∶5 000～1∶1 000）以及不同的酶切温度（4、16和20 ℃），我们找到了相对合适的酶切条件，即在EK∶His-VAS质量比为1∶1 000的情况下，20 ℃孵育12 h。见图7。

    在鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验中，剂量范围在0.5～10 μg·(鸡胚)-1之间的VAS蛋白（每个剂量均重复7只鸡胚）对鸡胚尿囊膜新血管的生成抑制呈剂量依赖性，与PBS对照组相比，VAS显著抑制了新血管的生成，如图9所示，给药部位心血管生成受到抑制而周边大血管代偿性增粗，实验中未观察到VAS的任何毒性作用。

    3  讨    论

    肿瘤的生长、转移及侵袭依赖于血管生成，即新血管的产生。血管生成抑制剂作为一种很有临床应用前景的抗癌制剂而被人们广泛深入地研究。在所有的血管生成抑制剂中，VAS是一种很有前景的候选物。作为一种分子量相对较小的分子很容易生产、转运，并且作为一种用于肿瘤及其他疾病中病理性血管生成的新型治疗制剂，VAS具有很好的应用前景。因此为进一步研究VAS的构效关系及其临床应用效果，低成本制备大量、高效、有生物活性的VAS蛋白的工作就迫在眉睫。

    在该研究中，我们开发出了一个可以高效表达和纯化完整的具生物学活性的人VAS蛋白系统。根据大肠杆菌的偏爱密码子，我们有目的地设计合成了VAS编码序列，从而最终增加了重组融合VAS蛋白的总表达水平，但是在大肠杆菌中，大多数重组 VAS蛋白倾向于形成包涵体（约占目的蛋白的95%）。虽然低温和分子伴侣共表达可以有效地提高目的蛋白的可溶性，但是同时也降低了目的蛋白的总表达量。另外，根据VAS蛋白分子量比较小，结构相对简单，没有二硫键的存在，体外复性比较容易（本研究中达到95％以上）等特点探索包涵体变复性的制备方法，才能最终得到比较理想的结果。

    本研究中，我们在37 ℃采用IPTG诱导后延长发酵时间的方法，较大程度地提高了目的蛋白的产量，95%以上的His-VAS都是以包涵体的形式存在。每升发酵液可以得到约120 mg的精制包涵体,经过变复性以及充分透析、超滤后，可以得到115 mg左右的重新折叠的融合蛋白His-VAS，纯度在85%以上，融合蛋白的复性效率很高，达95%以上。通过EK酶切后DEAE纯化，可以得到50 mg的不带任何冗余氨基酸的VAS蛋白，鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验证明其具有抑制新血管生成活性。

    事实上，我们采用摇瓶的发酵方法每升可以得到120 mg的包涵体，如果采用高密度发酵，该包涵体的产量有望提高1倍达到240 mg左右，那么目的蛋白最后的产率能达到100 mg·L-1。

    我们建立了VAS大肠杆菌基因工程高效表达菌株，表达水平高，分离纯化工艺简便，只需要包涵体一步精制就可以得到较纯的重组蛋白，成本低，为以后的VAS作为抑制血管生成，辅助肿瘤治疗的药物开发和深入研究奠定了坚实的基础。

【】
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