环孢菌素A、汉防己甲素及两者联合逆转K562/A02 细胞的多药耐药

【摘要】  目的:探讨环孢菌素A(CsA)、汉防己甲素(Tet)及两者联合应用对人白血病耐药细胞系K562/A02多药耐药的逆转作用。方法：采用MTT法测定柔红霉素(DNR)对细胞的半数抑制量(IC50),流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞内DNR浓度。结果:DNR对K562细胞和K562/A02细胞IC50分别为0.27和21.22 mg·L-1;CsA（1 mg·L-1）及Tet（0.1 mg·L-1）单独和联合处理K562/A02后，DNR的IC50分别为7.83、5.32和2.32 mg·L-1;CsA和Tet对DNR作用K562的IC50无明显影响；K562/A02细胞48 h凋亡率为2.19%，DNR(1 mg·L-1)作用K562/A02细胞凋亡率为2.70%，CsA和Tet单独及联合处理后凋亡率分别为10.27%、17.64%和52.79%；两药处理后细胞内化疗药物DNR浓度亦明显增加。结论:CsA及Tet均可逆转耐药,且联合作用逆转效果更强。

【关键词】  环孢菌素A; 汉防己甲素; K562/A02细胞; 多药耐药

    化疗是目前肿瘤的重要手段之一，而多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败的主要原因。P-糖蛋白(P-gp)介导的MDR是目前肿瘤MDR研究最多的主要机制之一，研究表明，其表达与细胞强大的药物外排能力有关［1］。环孢菌素A(CsA)是一种免疫抑制剂，可调节P-gp的功能,抑制P-gp的过度表达,逆转肿瘤细胞MDR［2］；汉防己甲素(Tetrandrine, Tet)是中药粉防己块根中的主要成分,是一种非特异性的Ca2+通道阻滞剂,研究表明它可以调节多种P-gp介导的MDR细胞株的耐药［3］。两种药物单独应用在体外实验中得到了一定的逆转耐药效果，但联合应用逆转MDR国内外尚无相关报道。为了寻求有效低毒的联合耐药逆转剂，为临床治疗白血病提供实验室依据，我们以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为实验研究对象进行体外实验，研究联合应用以上两种药物对MDR的逆转作用。

    1  材料和方法

    1.1  细胞系和培养条件

    敏感株K562及MDR株K562/A02由医学院血液学研究所提供,敏感细胞培养于含10%胎牛血清1640培养液中，K562/A02培养于含2 μmol·L- 1阿霉素、10 %胎牛血清1640培养液中,于实验前1周停用阿霉素。两种细胞均置于37 ℃、5%CO2培养箱中，2～3 d传代1次。

    1.2  实验器材、药物及试剂

    LDZ522离心机(北京医用离心机厂),SartoriusBS110S天平(北京赛多利斯天平有限公司),HZ28201K恒温振荡器(太仓市科教器材厂),Model 550酶标仪(日本BIO2RAD公司), FACSCAL BUR流式细胞仪(FCM，美国BD公司),柔红霉素（DNR,意大利Farmitalia公司）,CsA (瑞士山德士公司),Tet（江西银涛药业有限公司）,四甲基偶氮唑盐(MTT,Sigma公司,用PBS配制成5 g·L-1），胎牛血清(Hyclone公司)，RPMI 1640培养液(GIBCO公司)。

    1.3  方法

    1.3.1  实验分组  实验时取对数生长期细胞,细胞密度按不同实验要求进行调整:(1)对照组为K562或K562/A02细胞悬液;(2)DNR组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR；(3)DNR加Tet组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR和Tet；(4)DNR加CsA组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR和CsA；(5)DNR加Tet加CsA组为细胞悬液中加入一定剂量的DNR、Tet和CsA。

    1.3.2  MTT法测定逆转剂对DNR细胞毒性影响  参照及试剂盒说明进行。取对数生长期的耐药株和敏感株细胞，加入逆转剂(单用或联合,CsA终浓度1 mg·L-1,Tet终浓度2.5 mg·L-1)作用1 h,按所设梯度加入不同浓度DNR,每个浓度设3个复孔。血清培养液为调零孔组,不加药的细胞悬液为空白对照组,接种于96孔板,每孔含2×105个细胞悬液200 μl。置于37 ℃、5% CO2 培养箱孵育48 h后取出,加MTT反应液20 μl,继续培养4 h后于平板离心机上3 000 r·min-1离心10 min,弃上清,每孔加150 μl二甲亚砜溶解,微量振荡器混匀,酶标仪上测定540 nm波长的吸光度(A)。细胞的生长抑制率:

    生长抑制率(％)=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%。

    IC50 = 细胞生长抑制率为50%时的药物浓度

    耐药倍数= 耐药细胞IC50/ 敏感细胞IC50

    实验重复3次,每次设3个复孔,取平均值为最终结果。

    1.3.3  FCM检测细胞凋亡率  取K562/A02细胞,终浓度2×105 ml-1,根据实验分组分别加药(单用或联合，DNR终浓度1 mg·L-1，CsA终浓度1 mg·L-1,Tet终浓度0.1 mg·L-1),另设K562/A02对照组和只加DNR（1 mg·L-1）的K562/A02细胞对照组,分别孵育48 h后收集细胞,用4 ℃预冷的PBS洗涤两次,用1 ml blot buffer重悬细胞,各加入AnnexinⅤ-FITC 10 μl,另外设空白对照和FITC对照,常温避光15 min,洗涤细胞后在FCM上检测细胞凋亡情况。

    1.3.4  FCM检测细胞内DNR浓度  取K562/A02细胞株,终浓度2×105 ml-1,分组加药,分别孵育48 h,另设K562细胞及不加逆转剂K562/A02细胞对照组，分别加入DNR(终浓度1 mg·L-1),置于37 ℃、5%CO2培养箱孵育2 h,冷PBS液洗3次,1 500 r·min-1离心5 min,弃上清,用FCM测定细胞内DNR相对荧光强度，此值与DNR浓度成正比。

    1.4  统计学处理

    运用SPSS 13.0统计软件进行分析，显著性检验采用单因素方差分析,P<0.05为差异有显著性。

    2  结    果

    2.1  CsA和Tet的浓度选择

    CsA<5 mg·L-1、Tet<1 mg·L-1时对K562细胞无明显毒性,抑制作用不显著,故选择CsA 1 mg·L-1、Tet 0.1 mg·L-1作为实验浓度。

    2.2  逆转剂处理前后DNR对K562和K562/A02细胞的毒性作用    DNR对K562/A02细胞和K562细胞的IC50分别为21.22和0.27 mg·L-1,耐药倍数为79。用CsA（1 mg·L-1）处理后, DNR对K562 /A02细胞的IC50为7.83 mg·L-1,逆转倍数为2.71。Tet(0.1 mg·L-1)处理K562 /A02细胞后DNR IC50为5.32 mg·L-1,逆转倍数为3.39。两药联合对DNR作用K562 /A02细胞的IC50值为2.32 mg·L-1,逆转倍数为9.11。逆转剂对K562 /A02细胞的DNR毒性有明显影响(P<0.01，表1)。CsA（1 mg·L-1）处理后，DNR对K562细胞的IC50值为0.26 mg·L-1;Tet(0.1 mg·L-1)处理K562细胞后DNR的IC50为0.25 mg·L-1；两药联合对DNR作用K562细胞的IC50值为0.28 mg·L-1。逆转剂对DNR作用K562细胞的细胞毒性无明显影响(P>0.10，表2)。表1  DNR分别联合CsA和Tet及三药联合对K562/A02细胞毒性作用表2  DNR分别联合CsA和Tet及三药联合对K562细胞毒性作用

 

   2.3  Annexin Ⅴ检测细胞凋亡

    Annexin Ⅴ凋亡情况见图1。

    图1  不同药物及药物联合处理后K562/A02细胞的凋亡率（48 h,Annexin Ⅴ法）

    2.4  FCM检测细胞内DNR浓度

    未加逆转剂的K562/A02耐药株细胞内DNR相对荧光强度为103，而K562敏感株为522，前者是后者的19%，K562/A02经CsA(1 mg·L-1)、Tet(0.1 mg·L-1)及CsA(1 mg·L-1)加Tet(0.1 mg·L-1)联合作用48 h, 细胞内DNR荧光强度分别为310、339和515，分别为K562敏感株的60%、65%和98%。CsA处理组、Tet处理组及CsA 联合Tet处理组,细胞内DNR浓度均增加,两药联合组增加显著，与K562/A02对照组间有显著性差异(P<0.05)。

    3  讨    论

    肿瘤MDR的产生是多种因素共同作用的结果,目前研究表明，最主要的有以下几个方面：(1)促进肿瘤细胞内药物外排机制，包括 P-gp、多药耐药相关蛋白、肺耐药蛋白、乳腺癌耐药蛋白等ATP超家族介导的MDR，它们具有细胞膜离子“泵”样作用,可以将细胞内的药物“泵”到细胞外,使细胞内药物浓度降低从而产生耐药［4-6］。(2)酶类介导的MDR，包括糖基化神经酰胺合成酶、拓朴异构酶Ⅱ、谷胱苷肽S转移酶-π、磷酸激酶C等［7-9］。(3)细胞凋亡基因介导的MDR,包括p53基因突变、bcl-2原癌基因过表达等［10］。(4)其他,包括肿瘤细胞抗凋亡能力增强,DNA修复功能增强和微环境耐药(microenvironment resistance)等［11］。其中，P-gp过表达是肿瘤MDR中研究得最为广泛和深入的机制之一，成为临床克服多药耐药主要的靶点和观察指标。

    国内外众多实验室通过研究发现了多种MDR逆转剂,如钙离子通道阻滞剂、钙调蛋白抑制剂、亲脂性化合物、蛋白激酶C抑制剂、免疫抑制药物等，能克服肿瘤临床耐药和提高化疗疗效。但这些耐药逆转剂在临床上却存在着对心血管系统的副作用、免疫抑制作用、肝肾毒性，或在耐受剂量下逆转活性不高等不足。目前，联合使用逆转剂已成为耐药逆转研究的趋势。合理使用不同作用机制、毒副反应无叠加的两种或多种耐药逆转剂不但可起到协同增敏作用,而且可降低单一逆转药物剂量, 减少副作用, 提高耐受性［12］。

    本实验以寻求低毒高效的联合逆转剂为目的，对CsA和中药Tet共同作用逆转MDR进行体外研究。通过MTT预实验,CsA在5 mg·L-1及以下浓度、Tet在1 mg·L-1 及以下浓度, 对K562细胞系及K562/A02细胞系均无直接细胞毒性，我们选用1 mg·L-1 CsA和0.1 mg·L-1 Tet时发现，两药不能增强化疗药物DNR对K562细胞系的杀伤作用,但能明显增强DNR对K562/A02细胞系的杀伤作用。本研究显示，CsA及Tet均可以增加白血病细胞的凋亡率，同时可以明显增加细胞内DNR的浓度，并且两药联合时作用更强，为临床联合应用耐药逆转剂提供了理论依据。总之，药物的联合应用逆转白血病细胞MDR，既可减少药物的毒副作用，又增强了逆转效果，它具有广阔的临床应用前景。

【】
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